老年癡呆患者血清中miR-181a表達及臨床意義

曹光軍 武金程 王鵬飛

(鶴壁市人民醫(yī)院神經(jīng)內科，河南 鶴壁 458030)

老年癡呆是一種起病隱匿的進行性的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變〔1〕。臨床上的主要特征是記憶力障礙、執(zhí)行功能障礙、失語、失用、失認及人格和行為的改變等。并且隨著年齡的不斷增加，其發(fā)病率也逐漸升高，嚴重影響患者的生活，給家庭也帶來了極大的負擔〔2〕。miRNA是廣泛存在于動植物體內的非編碼單鏈小分子RNA，穩(wěn)定存在于外周血中，主要誘發(fā)蛋白質翻譯抑制調控蛋白質表達，并參與腫瘤的形成、胚胎發(fā)育和免疫等諸多過程。以往血清miR-181a的研究方向主要是癌癥及心血管疾病發(fā)展等方面，但有相關報告表示miR-181a能夠影響大腦海馬神經(jīng)元突觸生長，通過調控磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(Akt)/糖原合成酶激酶(GSK)3β信號通路對神經(jīng)元細胞的凋亡產生影響〔3,4〕，但目前尚未見miR-181a在癡呆患者血清中的表達及臨床意義的具體研究結果。因此為了更好地了解血清miR-181a水平對老年癡呆癥患者的意義，本研究主要探討血清miR-181a水平與老年癡呆患者臨床癥狀的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年2月至2018年12月在鶴壁市人民醫(yī)院收治的74例老年癡呆患者作為研究對象，男44例，女30例；年齡60～72歲，平均(70.35±7.89)歲。其中阿爾茨海默病(AD)組35例，男22例，女13例，平均(72.65±6.75)歲；輕度認知功能障礙(MCI)組39例，男22例，女17例，平均(74.58±7.25)歲。并選擇同期的健康老人45例作為對照組，男25例，女20例，平均(75.42±7.89)歲。三組對象的年齡、性別無明顯差異(P>0.05)，具有可比性。納入標準：①AD組患者均符合美國國家衰老研究所(NIA)與AD學會(AA)AD 診斷標準〔5〕，MCI組患者符合Petersen〔6〕修訂的MCI診斷標準；②AD患者的精神癥狀評分在14～23分，MCI患者的精神癥狀評分≥24分；③年齡≥60歲；④患者及家屬知曉本研究內容，并簽署知情同意書。排除標準：①嚴重肝腎功能不全；②患者病例資料不完整；③具有意識障礙，聽覺障礙；④既往有精神病史。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.2方法

1.2.1樣本收集 獲得患者及家屬的同意后，使用無抗凝劑的采血管在清晨空腹狀態(tài)下抽取外周靜脈血5 ml，并以2 500 r/min離心10 min，再使用PE管提取清液，存放至-80℃冰箱內備用。

1.2.2血清miRNA提取 從-80℃冰箱將所有樣品取出后向血清樣本中加入比例為1∶5的QIAzol溶解試劑進行統(tǒng)一溶解，在室溫下靜放10 min，再參照miRNA試劑盒上面的步驟提取血清總miRNA，并使用反轉錄試劑盒將RNA反轉為cDNA，置于-80℃冰箱保存。

1.2.3熒光定量聚合酶檢測血清miR-181a 采用美國Bio-Red公司的逆轉錄-試劑盒對SYBR Green real-time PCR進行操作，并使用廣州銳博生物有限公司合成的miR-181a或U6特異性上、下游引物，反應體系為15 μl。其PCR儀器設置參數(shù)為95℃、2 min、40個循環(huán)，93℃、15 s、30個循環(huán)，70℃、1 min、30個循環(huán)。并利用CFX manager 3.0軟件對Cq值進行分析，再通過2-△Ct法(△Ct=CTmiRNA-CTU6)計算miR-181a的相對表達量。

1.3觀察標準與測定方法 對所有研究對象進行全面檢測，根據(jù)身高、體重進行體重指數(shù)(BMI)的計算，但在檢測前是除去研究對象的衣服、鞋、帽子等所有影響計算結果的因素。一般采用簡單智力狀態(tài)檢查表(MMSE)，主要是從定向力、記憶力、注意力與計算力、回憶力及語言表達力等幾個方面進行評定，其評分標準分別為10分、3分、5分、3分、9分，總分為30分，分數(shù)越高，表示認知患者認知功能越好，一般大于27表示認知功能正常，檢測者均在安靜環(huán)境下進行〔7〕。對于血清中同型半胱氨酸(Hcy)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、脂聯(lián)素(ANP)水平表達量的檢測，其中Hcy、TC、TG、ANP水平表達量的酶測定是采用北京強生生物科技有限公司的試劑盒進行操作；LDL-C、HDL-C是采用直接測定法嚴格按照說明書進行操作。

1.4統(tǒng)計學分析 運用SPSS19.0進行χ2檢驗、t檢驗。

2 結 果

2.1三組臨床資料比較 三組教育程度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。三組LDL-C、Hcy、ANP、MMSE兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 三組基本資料比較

2.2三組miR-181a表達水平的比較 AD組血清中miR-181a的表達水平(1.25±0.35)高于MCI組(0.75±0.45)、對照組(0.56±0.75)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

2.3血清miR-181a表達與臨床指標的相關性分析 進一步分析老年癡呆患者中血清miR-181a水平與其他臨床血清指標的關系，其中血清miR-181a水平與血清Hcy水平呈正相關(r=0.568，P=0.004)，血清miR-181a水平與血清ANP水平、MMSE評分呈負相關(r=-0.562，P=0.001；r=-0.624，P=0.003)。

2.4老年癡呆患者采用Logistic回歸分析比較 以老年癡呆患者有無癡呆為因變量(否=0、是=1)，采用Logistic回歸分析，結果顯示教育程度(高中以上)為老年癡呆患者的保護因素，血清miR-181a≥0.78、Hcy≥19.25 mmol/L為老年癡呆患者的危險因素。見表2。

表2 老年癡呆患者采用Logistic回歸分析結果

3 討 論

老年癡呆最為常見的是AD，是一種不可逆的慢性進展性疾病，病情隱匿，早期不易被發(fā)現(xiàn)，具體因素并不明確〔8〕。但目前主要與神經(jīng)遞質、遺傳因素、免疫因素及環(huán)境因素等相關，主要特征性病理的改變是β淀粉樣蛋白沉積形成的細胞外老年斑和tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)細胞內神經(jīng)原纖維纏結及神經(jīng)原丟失伴膠質細胞增生等〔9〕。隨著病情的進一步發(fā)展患者逐漸出現(xiàn)了記憶力障礙、認知障礙、精神障礙及行為的異常，嚴重影響患者的社交、職業(yè)與生活功能〔10〕。目前對于老年癡呆患者的檢查主要是影像學、腦電圖、基因檢測及腦脊液檢測，但這些檢測并不完善，不能在早期快速準確安全的診斷該疾病，存在一定的缺陷〔11，12〕。因此有相關的學者提出老年癡呆的發(fā)生與外周血的相關指標水平有一定的關系。

人類成熟miR-181家族存在4種，分別是miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d，既往研究發(fā)現(xiàn)miR-181家族更多是與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關〔13，14〕，但張仕娟等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)急性腦梗死后認知功能受損患者血清miR-181c水平升高，血清miR-181c水平升高是急性腦梗死后認知功能受損的獨立危險因素和預測指標。miR-181a的表達含量在神經(jīng)組織中比較豐富，并與疾病的發(fā)生發(fā)展有著重要關系。有相關研究表明，miR-181a表達量過多會影響神經(jīng)突觸的分支數(shù)量及樹突的發(fā)育狀況，導致腦部疾病如AD的基因表達水平上升。miR-181a表達在AD的突觸可塑性中起著重要作用，當其表達量過高時，可對哺乳動物的認知功能造成一定的障礙，并參與調控學習和記憶力等認知功能、神經(jīng)再生及AD等神經(jīng)疾病〔16，17〕。本研究結果表示患者的認知功能與血清中miR-181a表達水平上升有關；血清miR-181a和Hcy水平表達量上升，血清ANP水平和精神癥狀下降，可以反映患者的認知功能的嚴重程度。采用Logistic回歸分析探討血清miR-181a水平與老年癡呆的關系，結果表明血清miR-181a可反映患者癡呆的程度。

Hcy是一種人體內的含硫氨基酸，為蛋氨酸和半胱氨酸代謝過程的重要中間產物，但本身不參與蛋白質的合成〔18〕。有相關研究顯示Hcy水平表達量過高，會降低人體的甲基化和抗氧化能力，容易導致老年癡呆的發(fā)生〔19，20〕。本研究結果顯示血清Hcy與老年癡呆癥的發(fā)生相關。ANP是由心房肌細胞合成并釋放的肽類激素，主要是調節(jié)中樞炎癥反應，保護血管內皮等作用，并有研究顯示血清ANP水平量過高時MCI患者的病情發(fā)展較慢〔21，22〕。本研究表明血清ANP水平表達量與AD相關。

綜上所述，檢測血清miR-181a的水平表達量能夠判斷老年癡呆患者臨床癥狀的嚴重程度，為患者的診斷及治療提供了一定的參考。但是由于研究的樣本量不足，因此更多研究結果，需進一步開展。