急性冠脈綜合征患者外周血單個核細胞中l(wèi)ncRNA表達

王麗輝 金鄂 唐屹 羅京霞 鄭萍 曾真

(荊門市第一人民醫(yī)院心功能室，湖北 荊門 448000)

人類基因組中有超過80%的基因被轉(zhuǎn)錄，但只有不到2%的基因最終編碼蛋白質(zhì)，這意味著大部分DNA序列被轉(zhuǎn)錄為非蛋白編碼的RNA。這些非編碼RNA中短鏈非編碼RNA如microRNAs，在潛在的疾病標志物及治療靶點等方面已經(jīng)進行過深入的研究〔1〕。近年來發(fā)現(xiàn)了一種新型的非編碼RNA，其長度超過200個核苷酸，被稱為長鏈非編碼RNA(lncRNA)，并不具有編碼蛋白的能力，但近期研究表明，lncRNA能以RNA的形式在多種層面上(表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平)調(diào)控基因的表達，參與了劑量補償效應(yīng)、基因組印跡、細胞發(fā)育分化等重要生物學過程〔2〕。雖然對lncRNAs功能和作用機制的研究尚處于起步階段，但已有不少證據(jù)表明lncRNA在腫瘤、免疫、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，是當前心血管疾病研究熱點之一〔3〕。研究表明，lncRNA參與調(diào)節(jié)心臟的發(fā)育〔4〕。心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄體(MIAT)位于染色體22q12.1上的心肌梗死易感位點，具有5個外顯子，且體外實驗表明MIAT不編碼任何蛋白質(zhì)，屬于一種lncRNA。研究發(fā)現(xiàn)MIAT轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)多個單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與心肌梗死易感性相關(guān)〔5，6〕，可能在轉(zhuǎn)錄后水平(剪接)調(diào)節(jié)基因表達〔7〕。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)是一種天然的HIF1α反義轉(zhuǎn)錄本，在心力衰竭患者中表達升高〔8〕，通過調(diào)節(jié)HIF1α的mRNA來調(diào)控新生血管生成，這對心肌缺血而言是一種重要的反饋。由此猜想lncRNAs可能作為急性冠脈綜合征(ACS)新的生物學標志物和治療靶點。本研究擬探討ACS患者外周血單個核細胞aHIF及MIAT的表達水平及其對ACS的診斷價值。

1 材料及方法

1.1研究對象 經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準及患者知情同意，收集荊門市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科住院部2016年9月至2017年2月確診的ACS患者91例，其中急性心肌梗死(AMI)42例，不穩(wěn)定型心絞痛(UA)49例，同時選取同時間段冠脈造影狹窄程度<50%的住院患者49例為對照組。所有患者行冠脈造影，根據(jù)病史、檢查結(jié)果、冠脈造影及手術(shù)報告并在2名經(jīng)驗豐富的冠脈介入醫(yī)師協(xié)助下進行分組。ACS診斷參照2014年美國心臟病學會(ACC)和美國心臟協(xié)會(AHA)發(fā)布的心血管診療指南標準。排除急性感染、腫瘤、腦卒中、血液系統(tǒng)疾病、嚴重肝、腎功能異常等患者。

1.2試劑 TRIzol?Reagent購自美國invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒和熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒購自日本TOYOBO公司；引物由上海生物工程有限公司合成；Epoch酶標儀購自美國BioTek公司；普通PCR儀購自美國Bio-Rad公司；LightCycler?480‖熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司。人外周血淋巴細胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司。

1.3標本采集 所有患者在進行冠脈造影前通過動脈導(dǎo)管收集外周血3 ml至乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中。ACS患者采血時間均在胸痛發(fā)作后(5.2±1.1)h內(nèi)。

1.4實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄(qRT)-PCR測定外周血細胞中l(wèi)ncRNA aHIF和MIAT水平 利用人外周血淋巴細胞分離液從人抗凝血中分離出單個核細胞，實驗步驟嚴格按照人外周血淋巴細胞分離液說明書操作。采用TRIzol?Reagent試劑從外周血單個核細胞中提取總RNA。Epoch酶標儀檢測RNA溶液D260/D280比值，計算RNA濃度及純度，取D260/D280比值在1.8～2.0者用于反轉(zhuǎn)錄。取500 ng RNA進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配10 μl反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為42℃ 15 min，98℃ 5 min，轉(zhuǎn)錄得到cDNA用于qRT-PCR反應(yīng)。以cDNA為模板，按照qRT-PCR試劑盒說明書進行操作，反應(yīng)條件：95℃ 3 min，95℃ 30 s，60℃ 1 min，35個循環(huán)。lncRNA-aHIF和MIAT的相對表達量采用2-ΔΔCt方法計算。引物序列見表1。

表1 引物序列號

1.5統(tǒng)計學分析 采用SPSS18.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析、秩和檢驗、Pearson相關(guān)性分析、受試者工作特征(ROC)曲線分析。

2 結(jié) 果

2.1一般資料 對照組與ACS組的年齡、性別、吸煙史、糖尿病史、高血壓史比較無明顯差異(P>0.05)，說明兩組受試者的基礎(chǔ)水平基本一致。ACS組肌鈣蛋白(cTn)I、肌酸肌酶(CK)、肌酸肌酶MB同工酶(CK-MB)水平顯著高于對照組，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)明顯低于對照組(P<0.05)。AMI亞組與UA亞組的收縮壓、HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、cTnI、CK、CK-MB水平均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，糖化血紅蛋白(HbA1c)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、舒張壓比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組受試者臨床資料比較

2.2各組受試者外周血單個核細胞中aHIF和MIAT的相對表達量 ACS組外周血細胞aHIF及MIAT表達水平顯著高于對照組(P<0.05)，AMI亞組外周血細胞aHIF表達水平顯著高于對照組和UA亞組(P<0.05)。UA亞組外周血細胞MAIT表達水平顯著高于對照組和AMI亞組(P<0.05)，見表3。

表3 各組受試者外周血單個核細胞中aHIF和MIAT的相對表達量

2.3AMI亞組外周血細胞aHIF及MIAT水平與CK、CK-MB、cTnI水平的相關(guān)性 AMI亞組外周血細胞aHIF、MIAT水平與cTnI、CK-MB無相關(guān)性(P>0.05)；aHIF與CK呈弱正相關(guān)(r=0.317，P<0.05)，與MIAT無相關(guān)性(P>0.05)。

2.4外周單個核細胞aHIF、MIAT對ACS和AMI診斷的ROC曲線 aHIF對ACS及AMI診斷的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.791(95%CI：0.741～0.840，P<0.01)、0.838(95%CI：0.780～0.895，P<0.01)。以aHIF的約登指數(shù)對應(yīng)的最大切點0.422為最佳臨界點，aHIF對ACS的診斷臨界值為0.002 144 829(2-ΔΔCt值)，其敏感度為60.2%，特異度為82.0%。以aHIF的約登指數(shù)對應(yīng)的最大切點0.589為最佳臨界點，aHIF對AMI的診斷臨界值為0.002 282 892(2-ΔΔCt值)，其敏感度為59.0%，特異度為98.0%。見圖1、2。MIAT對ACS及AMI診斷的ROC曲線分析AUC均小于0.5，不考慮其對診斷有意義。

圖1 aHIF診斷ACS的ROC曲線

圖2 aHIF診斷AMI的ROC曲線

3 討 論

ACS是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(簡稱冠心病)中比較嚴重的類型，發(fā)現(xiàn)并利用冠心病相關(guān)的生物標志物更快速、準確、早期識別冠心病高危人群與診斷ACS一直是當今的研究熱點。對冠心病乃至ACS的診斷、病情評估、危險分層、預(yù)后判斷等方面的生物標志物的研究已比較成熟，對冠心病的診斷治療及管理發(fā)揮了重要總用。但須認識到，單一的標志物一般只反映疾病發(fā)生的某個環(huán)節(jié)，檢測具有局限性，因此國內(nèi)外不少學者專家推薦多種生物標志物聯(lián)合診斷冠心病，從多方面評估病情，為疾病治療提供有效靶點〔9〕。

近年來lncRNAs逐漸成為研究熱點，研究表明，lncRNAs不但在生理性心臟發(fā)育、心臟各類型細胞分化和轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用，而且在心臟疾病，如心肌肥厚、心力衰竭、心肌梗死和心臟缺血再灌注損傷等病理性疾病發(fā)生發(fā)展中也起關(guān)鍵作用〔10〕。在冠心病方面，aHIF可以通過調(diào)節(jié)HIF1α信使RNA的穩(wěn)定性來調(diào)節(jié)微血管生成，這對心臟缺血時非常重要。一項納入414例行經(jīng)皮冠脈介入術(shù)開通犯罪血管的AMI患者的研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生AMI后，外周血細胞lncRNA的表達水平受到嚴格調(diào)控，且與左心室功能不全程度、心肌損傷標志物、心血管疾病危險因素相關(guān)；與健康受試者相比，心肌梗死患者外周血細胞aHIF表達升高〔11〕。本研究提示，aHIF可能對AMI的早期診斷有一定幫助。

Ishii等〔12〕使用52 608個基于單倍體的單核苷酸多態(tài)性標志物進行大規(guī)模病例對照關(guān)聯(lián)研究，發(fā)現(xiàn)位于染色體22q12.1上的心肌梗死易感位點，在此位點上分離出MIAT，且體外實驗表明MIAT不編碼任何轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，是一種功能性RNA，同時通過全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)lncRNA MIAT轉(zhuǎn)錄區(qū)多個SNPs與心肌梗死易感性相關(guān)。MIAT主要存在于特殊的核小體中，與剪接因子類固醇生成因子有高度親和力，可能在轉(zhuǎn)錄后水平(剪接)調(diào)節(jié)基因表達〔7〕。對成年雄性小鼠行冠狀動脈結(jié)扎術(shù)制造AMI模型，對其進行微陣列分析顯示MIAT1和MIAT2升高最顯著，分別為5倍和13倍，進一步分析發(fā)現(xiàn)這兩種lncRNA在心肌梗死后24 h達到高峰，且2 d后恢復(fù)至基線水平〔6〕。本實驗與Vausort等〔11〕報道結(jié)果一致，考慮可能為升高機制及升高時間等方面的差異，有待進一步研究證實。

已經(jīng)證明衡量外周血細胞中l(wèi)ncRNA水平對冠狀動脈疾病高危患者有預(yù)測價值〔13〕。本研究中僅CK與aHIF有較弱相關(guān)性，考慮原因可能為：(1)兩者存在位置不同，升高機制不一樣；(2)時間關(guān)系，導(dǎo)致外周血細胞中aHIF和MIAT與外周CK、CK-MB、cTnI外周血升高不同步。綜上，本次臨床研究證實了aHIF和MIAT在ACS患者外周血細胞中表達水平發(fā)生改變，其中aHIF表達水平升高，有望作為ACS診斷的潛在標志物及治療靶點。