枝頂孢霉屬內(nèi)生真菌CEF-193 對(duì)棉花黃萎病的控制作用

張向月，趙麗紅，馮鴻杰，魏鋒，張亞林，朱荷琴，馮自力

（棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，河南安陽(yáng)455000）

中國(guó)每年有超過13 萬(wàn)hm2的棉花被黃萎病侵害[1-2]。 棉花黃萎病主要是由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）引起，通過侵染棉花根部，導(dǎo)致棉花植株逐漸死亡，嚴(yán)重威脅棉花的產(chǎn)量和纖維品質(zhì)。 大麗輪枝菌宿主十分廣泛，以對(duì)環(huán)境脅迫具有很強(qiáng)抵抗力的微菌核形態(tài)度過休眠期， 在土壤中存活多年，且可以在棉花的各個(gè)生長(zhǎng)階段進(jìn)行侵染，因此很難防控[3-8]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，由于難以實(shí)施輪作，田間棉花連作往往導(dǎo)致土壤中病原數(shù)量過多，極易發(fā)生病害，而目前仍缺乏對(duì)大麗輪枝菌抗性優(yōu)良的棉花品種和強(qiáng)效殺菌劑，生物防治因其無(wú)污染、易開發(fā)等優(yōu)點(diǎn)，成為防控黃萎病的重要手段[9-10]。

許多研究表明植物內(nèi)生真菌具有促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)、增強(qiáng)植物的抗病害能力等作用。 2014 年，Li 等[11]在棉花上分離并篩選出了7 株內(nèi)生真菌，其中菌株CEF-193 對(duì)棉花黃萎病菌具有較高抑菌活性。 為進(jìn)一步明確該菌株對(duì)棉花黃萎病的防治效果， 本課題組于2016―2017 年在河南安陽(yáng)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所溫室和試驗(yàn)地開展了相關(guān)研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下，以期為黃萎病的有效控制提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試棉花品種為魯棉研21， 為黃河流域棉區(qū)主栽品種， 供試菌株為大麗輪枝菌強(qiáng)致病力菌株Vd080，均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所棉花病害課題組提供。CEF-193 發(fā)酵液和固體菌劑按下述方式制備。

CEF-193 發(fā)酵液：在發(fā)酵罐中加入察氏培養(yǎng)基滅菌后，再加入CEF-193 的分生孢子懸浮液（孢子含量為1×107mL－1，體積為培養(yǎng)基的5%），于25 ℃下發(fā)酵培養(yǎng)3 d 獲得發(fā)酵原液。 將制備好的發(fā)酵原液稀釋至孢子含量1×107mL－1即為試驗(yàn)用發(fā)酵液。

固體菌劑： 裝有質(zhì)量比為1∶1 的玉米和蛭石的克氏瓶經(jīng)滅菌后， 接種5 mL CEF-193 的分生孢子懸浮液（孢子含量為1×107mL－1），25 ℃暗培養(yǎng)7 d 后取出培養(yǎng)物，自然風(fēng)干制成固體菌劑。

1.2 菌株CEF-193 對(duì)棉花黃萎病的溫室防治效果測(cè)定

棉花種植： 在溫室中種植魯棉研21 棉花種子于盆中，以每盆8 粒種子的密度種植，每6 個(gè)盆栽作為1 個(gè)處理。 待棉花幼苗第一片真葉初現(xiàn)時(shí)，進(jìn)行試驗(yàn)處理。

發(fā)酵液噴霧： 將CEF-193 發(fā)酵液均勻噴施在棉花幼苗上，直至葉片完全濕潤(rùn)，對(duì)照用清水噴施，每個(gè)處理3 次重復(fù)。 處理后第4 天時(shí)，每盆通過灌根接種孢子含量1×107mL－1的Vd080 分生孢子懸浮液50 mL。

發(fā)酵液灌根： 每盆棉花用CEF-193 發(fā)酵液50 mL 灌根，以清水作為對(duì)照，每個(gè)處理3 次重復(fù)。 處理后第4 天時(shí)均按上面方法接種Vd080 分生孢子懸浮液。

固體菌劑混土： 將固體菌劑按質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%與蛭石沙土基質(zhì)均勻混合， 裝入盆中種植魯棉研21的種子， 待第一片真葉初現(xiàn)時(shí)按上面方法接種Vd080 分生孢子懸浮液。以蛭石沙土基質(zhì)混合無(wú)菌培養(yǎng)物的盆栽作為對(duì)照，每個(gè)處理3 次重復(fù)。

發(fā)病調(diào)查： 上述3 種處理均在接菌25 d 后參照5 級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病害調(diào)查[12]。 病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，葉片發(fā)病面積占比為0；1 級(jí)，0＜葉片發(fā)病面積占比≤33%；2 級(jí)，33%＜葉片發(fā)病面積占比≤66%；3 級(jí)：66%＜葉片發(fā)病面積占比＜100%；4 級(jí)：葉片發(fā)病面積占比為100%。

1.3 菌株CEF-193 對(duì)棉花黃萎病的大田防治效果測(cè)定

大田棉花種植：2017 年4 月下旬在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所連年嚴(yán)重發(fā)生黃萎病的棉花試驗(yàn)田中種植魯棉研21 號(hào)， 種植密度為5 萬(wàn)株·hm－2。 根據(jù)試驗(yàn)處理設(shè)置小區(qū)， 隨機(jī)排列，3 次重復(fù)，每個(gè)小區(qū)4 行，行長(zhǎng)8 m，行距0.8 m。

發(fā)酵液噴霧：于6 月初，將制備好的CEF-193 發(fā)酵液稀釋8 倍，噴施在棉苗上，每小區(qū)用量8 L。

發(fā)酵液灌根：待棉花出苗后，在棉花根部灌根CEF-193 發(fā)酵液， 每小區(qū)用量4 L。 之后每隔15 d灌根1 次，共4 次，對(duì)照灌根等量清水。

固體菌劑隨種撒施： 播種時(shí)將菌株CEF-193固體菌劑撒在種溝里，1 m 行長(zhǎng)的菌劑用量為30 g。

發(fā)病調(diào)查：上述3 種處理均在發(fā)病后（播種后第60 天和第80 天） 按照1.2 所述方法進(jìn)行病害調(diào)查。

1.4 棉花產(chǎn)量和纖維品質(zhì)測(cè)定

棉花收獲期在小區(qū)隨機(jī)收取50 個(gè)吐絮棉鈴用于檢測(cè)纖維品質(zhì)， 同時(shí)收取6.67 m2內(nèi)的棉花計(jì)算籽棉產(chǎn)量。纖維樣品送農(nóng)業(yè)農(nóng)村部棉花品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心檢測(cè)（HVICC 校準(zhǔn)）纖維品質(zhì)5 項(xiàng)指標(biāo)（上半部平均長(zhǎng)度、長(zhǎng)度整齊度指數(shù)、斷裂比強(qiáng)度、馬克隆值和斷裂伸長(zhǎng)率）。

1.5 計(jì)算公式與統(tǒng)計(jì)方法

計(jì)算公式：DI＝Σ（Ni×i）/（N×4）×100，式中DI 為病情指數(shù)，Ni為各級(jí)病株數(shù)，i 為病級(jí)數(shù)值，N為調(diào)查總株數(shù)；E（%）＝（DI0－DI1）/DI0×100，式中E 為防治效果（防效），DI0為對(duì)照病情指數(shù)，DI1為處理病情指數(shù)[13]。

統(tǒng)計(jì)方法：采用SPSS（V22.0）軟件進(jìn)行平均值的差異顯著性分析（t 檢驗(yàn)法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 CEF-193 對(duì)棉花黃萎病的溫室防治效果

由表1 可見，在溫室中，將真菌CEF-193 通過發(fā)酵液噴霧、發(fā)酵液灌根、固體菌劑混土3 種方式外施至棉花植株后，棉花黃萎病發(fā)病顯著減輕。 其中固體菌劑處理的防治效果最好， 其次是灌根處理，再次是噴霧處理。

表1 溫室中3 種接菌方式下CEF-193 對(duì)棉花黃萎病的防治效果

2.2 CEF-193 對(duì)棉花黃萎病的大田防治效果

如表2 所示， 在大田中， 播種后第60 天和第80 天， 固體菌劑隨種撒施處理的病情指數(shù)顯著低于相應(yīng)對(duì)照，防效分別為33.8%和27.1%；發(fā)酵液灌根處理防效分別為22.2%和20.6%；發(fā)酵液噴霧處理防效略低， 分別為23.2%和15.5%。 3 種CEF-193 處理均顯著減輕了棉花黃萎病的發(fā)病程度，其中固體菌劑隨種撒施的防治效果最好。

2.3 CEF-193 對(duì)大田棉花纖維品質(zhì)和產(chǎn)量的影響

在大田試驗(yàn)中，發(fā)酵液噴霧處理與相應(yīng)對(duì)照相比，鈴重增加了6.7%；發(fā)酵液灌根處理與相應(yīng)對(duì)照相比，籽棉產(chǎn)量增加了8.4%，增產(chǎn)顯著；固體菌劑隨種撒施處理對(duì)棉花產(chǎn)量無(wú)顯著作用。 3 種CEF-193處理對(duì)棉花纖維品質(zhì)均無(wú)顯著影響（表3）。

3 討論與結(jié)論

棉花黃萎病的防治方式多樣，其中生物防治安全性高，對(duì)環(huán)境影響小，易開發(fā)且成本低，不容易產(chǎn)生抗性問題，是防治黃萎病的重要手段[14]。 許多生防微生物可產(chǎn)生多種抗生素、 胞外酶等活性物質(zhì)，在土傳病害防治方面具有較好的應(yīng)用前景[15-18]。 其中植物內(nèi)生菌是研究的熱點(diǎn)，已經(jīng)取得一些研究成果，2014 年Li 等[11]在棉花上分離出642 株內(nèi)生真菌，并從中篩選出7 株對(duì)棉花黃萎病菌具有較高抑菌活性的菌株， 分別為CEF-714（Leptosphaeria sp.）、CEF-642 （Talaromyces flavus）、CEF-026（Gibberella intermedia）、CEF-193 （Acremonium sp.）、CEF-325 （Fusarium solani）、CEF-818 （Penicillium simplicissimum）和CEF-109（Ascomycete sp.）。本研究進(jìn)一步通過溫室和大田試驗(yàn)， 對(duì)CEF-193 防治棉花黃萎病的效果進(jìn)行了驗(yàn)證。

本研究先在溫室中開展試驗(yàn)， 將CEF-193 通過發(fā)酵液噴霧、發(fā)酵液灌根、固體菌劑3 種方式處理棉花植株，發(fā)現(xiàn)處理后均顯著減輕了棉花黃萎病的發(fā)病程度，其中固體菌劑處理的防效最好，達(dá)到了52.7%。 之后在大田中進(jìn)一步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)3 種處理均使棉花黃萎病發(fā)病顯著減輕，防效在15.5%～33.7%。其中固體菌劑處理的防效最高，其次是發(fā)酵液灌根處理和噴霧處理。與已有報(bào)道的枝頂孢霉屬內(nèi)生真菌相比，CEF-193 的大田防效稍遜于CEF-082 和CEF-373[17]，但CEF-193 通過固體菌劑處理的方式也可取得較好的防效。 另外，CEF-193處理可使棉花增產(chǎn)。 其中，其發(fā)酵液噴霧處理的棉花鈴重顯著增加6.7%， 灌根處理的籽棉產(chǎn)量顯著增加8.4%。

本研究驗(yàn)證了生防菌CEF-193 可以有效減輕黃萎病發(fā)病，并且可顯著提高棉花產(chǎn)量，具有較好的應(yīng)用前景，為棉花黃萎病的有效防治提供了技術(shù)支撐。