雙翅目害蟲(chóng)性別分離技術(shù)的研究進(jìn)展及展望

彭 威,李云欣,翁詩(shī)函,周若涵,潘 熙,李佳洋,韓寶瑜

(中國(guó)計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,杭州 310018)

雙翅目病媒昆蟲(chóng)每年導(dǎo)致數(shù)百萬(wàn)人和家畜感染寄生蟲(chóng)和病毒，因而發(fā)展新型有效的防治技術(shù)顯得異常重要(Kassebaumetal.,2016)。昆蟲(chóng)不育技術(shù)(sterile insect technique,SIT)是害蟲(chóng)區(qū)域防治的主要技術(shù)之一。傳統(tǒng)的不育昆蟲(chóng)技術(shù)概念最早由Knipling在20世紀(jì)40年代提出來(lái)，其主要策略是通過(guò)大量人工飼養(yǎng)靶標(biāo)害蟲(chóng)，經(jīng)過(guò)輻射處理后，連續(xù)釋放不育雄性個(gè)體，與野生靶標(biāo)雌性害蟲(chóng)個(gè)體交配，產(chǎn)生不育后代，將靶標(biāo)害蟲(chóng)種群數(shù)量控制在經(jīng)濟(jì)閾值之下，甚至徹底根除靶標(biāo)害蟲(chóng)(Knipling,1955)。但傳統(tǒng)的SIT由于使用輻照技術(shù)造成雄蟲(chóng)在野外生存力和交配競(jìng)爭(zhēng)力降低，而且缺乏有效的雌雄區(qū)分手段，因此在實(shí)踐中有諸多限制。SIT是一種更環(huán)保的廣譜化學(xué)殺蟲(chóng)劑替代品，已成功應(yīng)用于多種害蟲(chóng)的防治，但在釋放之前必須先將雌性移除，這導(dǎo)致其防治速度放慢。除了盡量減少釋放雌性所帶來(lái)的健康和經(jīng)濟(jì)風(fēng)險(xiǎn)之外，模型和實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明僅釋放雄性比同時(shí)釋放雄性和雌性更具成本效益(Knipling,1955;Rendonetal.,2004)。節(jié)約的成本可能是由于昆蟲(chóng)大規(guī)模飼養(yǎng)的成本降低和田間釋放的雄性不會(huì)被同時(shí)釋放的雌性所吸引。

其他遺傳防治措施包括釋放攜帶顯性致死的昆蟲(chóng)不育技術(shù)(release of insects carrying a dominant lethal,RIDL)和基于沃爾巴克氏體Wolbachia的昆蟲(chóng)不相容技術(shù)(incompatible insect technique,IIT)。RIDL通過(guò)釋放攜帶可抑制的顯性致死轉(zhuǎn)基因雄蟲(chóng)與野生雌蟲(chóng)交配，導(dǎo)致后代在特定發(fā)育階段或特定性別中條件致死(Thomas,2000)。由于需要釋放大量轉(zhuǎn)基因個(gè)體使得其應(yīng)用成本相當(dāng)昂貴，且四環(huán)素抑制系統(tǒng)會(huì)降低RIDL雄蟲(chóng)的適應(yīng)性(Alpheyetal.,2010)。IIT通過(guò)釋放攜帶與野生雌蚊不同沃爾巴克菌型的雄蚊，從而誘發(fā)胞質(zhì)不相容，使雌蚊不育(Sinkins,2004;Panagiotis and Bourtzis,2007)。IIT雖然不會(huì)降低雄蚊的競(jìng)爭(zhēng)交配力和生存力，但是在田間條件下嚴(yán)格要求沒(méi)有感染的雌性被釋放是極其困難的。模型實(shí)驗(yàn)顯示，釋放只有一小部分感染W(wǎng)olbachia的雌性會(huì)導(dǎo)致種群替代而不是種群滅絕。雌性蚊子能傳播病原菌，任何遺傳控制策略中都不能容忍雌性污染。在這些遺傳防治措施的應(yīng)用中，性別分離是指將雄性和雌性進(jìn)行分離，更確切地說(shuō)是移除雌性。性別分離一方面依賴(lài)于性二態(tài)差異的機(jī)械分離，另一方面可以利用更復(fù)雜的技術(shù)來(lái)調(diào)控基因表達(dá)，從而在發(fā)育過(guò)程中條件性地將雌蟲(chóng)雄性化或殺死雌性。

昆蟲(chóng)性別決定和發(fā)育已被多次闡述，主要關(guān)注特定種或?qū)偌靶詣e調(diào)控分子機(jī)制(Alphey,2014;Gillesetal.,2014;Bernardinietal.,2018)。在本文中，我們對(duì)雙翅目昆蟲(chóng)最近開(kāi)發(fā)的所有性別分離策略進(jìn)行綜述，關(guān)注的對(duì)象不僅包括蚊子在內(nèi)的病媒昆蟲(chóng)，還包括其他雙翅目農(nóng)業(yè)重要性害蟲(chóng)，這些新的性別分離技術(shù)可以完善基于靶標(biāo)性別決定的昆蟲(chóng)不育防治技術(shù)。本文側(cè)重于性別分離方法的可操作性，對(duì)目前正在進(jìn)行的性別分離技術(shù)進(jìn)行了比較，探討了大規(guī)模飼養(yǎng)中每項(xiàng)技術(shù)創(chuàng)新的優(yōu)缺點(diǎn)。

1 雙翅目昆蟲(chóng)大規(guī)模釋放中的性別分離現(xiàn)狀

目前大多數(shù)針對(duì)實(shí)蠅害蟲(chóng)的遺傳防治策略沒(méi)有進(jìn)行性別分離。例如，澳大利亞和泰國(guó)果實(shí)蠅屬Bactrocera大規(guī)模飼養(yǎng)設(shè)施每周能生產(chǎn)數(shù)以千萬(wàn)計(jì)的沒(méi)有移除雌性的果實(shí)蠅(Orankanoketal.,2007;Fansonetal.,2014)。通過(guò)每周釋放1 500萬(wàn)頭不育對(duì)旋麗蠅Cochliomyiahominivorax對(duì)巴拿馬-哥倫比亞邊境的對(duì)旋麗蠅進(jìn)行防治，其中沒(méi)有大規(guī)模的性別分離策略(Scottetal.,2017)。而隨著不育對(duì)旋麗蠅生產(chǎn)規(guī)模的增加，一種基于四環(huán)素抑制系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因品系導(dǎo)致雌蟲(chóng)在蛹期雌性特異性致死，從而實(shí)現(xiàn)蛹期性別分離用于對(duì)旋麗蠅的防治，預(yù)計(jì)每年可節(jié)省超過(guò)100萬(wàn)美元(Conchaetal.,2016)。到目前為止，只有地中海實(shí)蠅Ceratitiscapitata和墨西哥實(shí)蠅Anastrephaludens兩種農(nóng)業(yè)重要性實(shí)蠅在大規(guī)模飼養(yǎng)中采用性別分離策略，極大提高了釋放效率(Augustinosetal.,2017)。

在必須進(jìn)行性別分離的情況下，耗時(shí)的方法通常是唯一可行的選擇。蚊亞科包括伊蚊屬Aedes和庫(kù)蚊屬Culex，性二態(tài)表現(xiàn)為蛹大小不一致，已經(jīng)對(duì)伊蚊采用基于蛹的大小進(jìn)行機(jī)械性別分離(Papathanosetal.,2018)。在意大利SIT防治中，利用金屬篩對(duì)200萬(wàn)頭白紋伊蚊Aedesalbopictus雄蟲(chóng)進(jìn)行了性別分離，該方法僅回收了26%～29%的雄蟲(chóng)，雌蟲(chóng)污染仍約為1.2%(Bellinietal.,2013)?；诖菩塾即笮〉腇ay-Morlan玻璃分選機(jī)，對(duì)中國(guó)兩個(gè)島上的白紋伊蚊進(jìn)行了昆蟲(chóng)不相容技術(shù)和不育技術(shù)相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)，釋放了超過(guò)1.97億頭雄蚊。雄蚊恢復(fù)較多，雌蚊污染率約為0.3%(Zhengetal.,2019)。利用基于性二態(tài)的方法對(duì)留尼旺島的白紋伊蚊和法屬波利尼西亞的埃及伊蚊Aedesaegypti和波利尼西亞伊蚊Aedespolynesiensis進(jìn)行防治，從而控制登革熱的發(fā)生。目前按蚊性別分離方法是基于蚊蛹人工識(shí)別，每小時(shí)只能對(duì)500頭蚊蛹進(jìn)行性別分離(Papathanosetal.,2018)。這導(dǎo)致工期非常長(zhǎng)，很難獲得害蟲(chóng)不育防治中所需的蚊蟲(chóng)數(shù)量。采采蠅Glossinamorsitansmorsitans雌雄蟲(chóng)均以血液為食，可作為錐蟲(chóng)的載體。釋放少量錐蟲(chóng)殺滅劑處理的采采蠅雄蟲(chóng)可以通過(guò)成蟲(chóng)人工分離，而大量釋放可以利用雌蛹羽化早于雄蛹進(jìn)行分離(Bouyeretal.,2014;Secketal.,2015)。基于雌蛹羽化早于雄蛹的性別分離方法生產(chǎn)了500萬(wàn)頭須舌蠅Glossinapalpalisgambiensis雄蟲(chóng)，用于消除塞內(nèi)加爾的須舌蠅(Secketal.,2015)。

在蛹期或成蟲(chóng)期進(jìn)行性別分離需要對(duì)雌雄幼蟲(chóng)進(jìn)行飼喂，在不育防治釋放中只需要雄蟲(chóng)，因而雌蟲(chóng)被丟棄只僅保留雄蟲(chóng)。此外，增加幼蟲(chóng)密度會(huì)降低其適應(yīng)性并減緩雌雄幼蟲(chóng)發(fā)育(Agnewetal.,2002)。因此，在昆蟲(chóng)發(fā)育早期移除雌蟲(chóng)有利于避免雌雄之間的競(jìng)爭(zhēng)(Phucetal.,2007)。在飼養(yǎng)數(shù)百萬(wàn)頭害蟲(chóng)時(shí)，早期的性別分離可以節(jié)省大量的時(shí)間、勞動(dòng)力和金錢(qián)。在大規(guī)模飼養(yǎng)蚊蟲(chóng)中，早期的性別分離可以降低雌蚊飼咬工人的風(fēng)險(xiǎn)。釋放性別分離后的不育雄性個(gè)體，通過(guò)與野外靶標(biāo)雌性害蟲(chóng)個(gè)體交配，產(chǎn)生不育后代，能夠降低靶標(biāo)害蟲(chóng)種群密度，甚至徹底根除靶標(biāo)害蟲(chóng)。

2 雙翅目昆蟲(chóng)性別決定及分化機(jī)制

雙翅目昆蟲(chóng)具有多種機(jī)制決定性別和分化(圖1)。模式物種黑腹果蠅Drosophilamelanogaster是XX/XY染色體性別決定系統(tǒng)，雌性個(gè)體雙倍劑量的X染色體連接信號(hào)元件(X chromosome-linked signal elements,XSE)作為初始性別決定因子啟動(dòng)Sexlethal(Sxl)基因的表達(dá)，SXL蛋白指導(dǎo)transformer(tra)和doublesex(dsx)基因mRNA前體進(jìn)行雌性特異剪切(traf,dsxf)，雌性特異DSX蛋白指導(dǎo)雌性分化。XY個(gè)體單倍劑量的XSE不足以啟動(dòng)Sxl基因的表達(dá)，導(dǎo)致tra和dsx基因mRNA前體進(jìn)行雄性特異剪切(tram,dsxm)，產(chǎn)生雄性特異DSX蛋白指導(dǎo)雄性分化(Erickson and Quintero,2008;Lucchesi and Kuroda,2015;Vicoso and Bachtrog,2015)。在家蠅Muscadomestica中，性別決定系由雄性決定因子maledeterminer(Mdmd)的存在與否來(lái)決定。在XY雄性胚胎中，父本繼承的Mdmd阻止合子中母本tra正向反饋調(diào)控表達(dá)，導(dǎo)致tra和dsx基因進(jìn)行雄性特異剪切，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)雄性決定和雄性性別分化。在XX雌性胚胎中，缺少M(fèi)dmd基因，來(lái)源于母本的tra基因產(chǎn)物在雌性中建立一個(gè)自動(dòng)調(diào)控通路，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生有功能的TRA蛋白，TRA蛋白指導(dǎo)dsx進(jìn)行雌性特異剪切，完成雌性性別決定和分化(Sharmaetal.,2017)。地中海實(shí)蠅性別決定基本信號(hào)是位于Y染色體的雄性決定因子Maleness-onthe-Y(MoY) (Meccarielloetal.,2019)。Y染色體連接的MoY阻止合子中tra基因活化，導(dǎo)致tra基因進(jìn)行雄性特異剪切，引起雄性發(fā)育。XX胚胎由于缺乏MoY基因，tra雌性特異自動(dòng)調(diào)節(jié)回路被激活產(chǎn)生功能蛋白，推動(dòng)雌性性別發(fā)育(Paneetal.,2002;Gabrielietal.,2010)。蚊子性別是由位于Y染色體上的雄性決定因子調(diào)控的，埃及伊蚊、岡比亞按蚊Anophelesgambiae和斯氏按蚊Anophelesstephensi雄性決定基因Nix,Yob和Guy1調(diào)控dsx基因進(jìn)行雄性別特異性剪切和表達(dá)，實(shí)現(xiàn)雄性性別發(fā)育。雌性缺少Nix,Yob和Guy1基因，導(dǎo)致dsx基因進(jìn)行雌性特異性剪切和表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)雌性性別發(fā)育(Halletal.,2015;Criscioneetal.,2016;Krzywinskaetal.,2016)。

圖1 雙翅目昆蟲(chóng)性別決定途徑(Erickson and Quintero,2008;Hall et al.,2015;Criscione et al.,2016; Krzywinska et al.,2016;Sharma et al.,2017;Meccariello et al.,2019)Fig.1 Sex determination pathways in dipteran insects (Erickson and Quintero,2008;Hall et al.,2015;Criscione et al.,2016; Krzywinska et al.,2016;Sharma et al.,2017;Meccariello et al.,2019)dsxf：doublesex轉(zhuǎn)錄本的雌性特異性亞型 Female-specific isoform of the doublesex transcript;dsxm:doublesex轉(zhuǎn)錄本的雄性特異性亞型Male-specific isoform of the doublesex transcript;traf:transformer轉(zhuǎn)錄本的雌性特異性亞型Female-specific isoform of the transformer transcript;tram:transformer轉(zhuǎn)錄本的雄性特異性亞型Male-specific isoform of the transformer transcript.

3 雙翅目昆蟲(chóng)性比失衡性別分離策略

鑒定昆蟲(chóng)雌性性別發(fā)育關(guān)鍵的基因，從而破壞其性別決定途徑的防治策略已在多種害蟲(chóng)中得以應(yīng)用，利用RNA干擾(RNA interference,RNAi)、clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9)敲除和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在昆蟲(chóng)胚胎發(fā)育早期對(duì)性別決定關(guān)鍵基因進(jìn)行調(diào)控可以產(chǎn)生雄性偏向的種群(表1)。性別完全分離成本效益較低的方法是生產(chǎn)包括雄蟲(chóng)和部分雌蟲(chóng)雄性化組成的種群，通過(guò)以上方法生產(chǎn)的雄性化雌蟲(chóng)通常是不育。在飼養(yǎng)設(shè)施中，這些雌蟲(chóng)仍將與雄蟲(chóng)競(jìng)爭(zhēng)食物和空間，在田間釋放該種群防治害蟲(chóng)時(shí)效率更高。地中海實(shí)蠅轉(zhuǎn)基因品系在熱激啟動(dòng)子調(diào)控下表達(dá)雙鏈RNA靶向性別決定關(guān)鍵基因tra，產(chǎn)生95%雄性和5%雙性后代，大多數(shù)基因型雌性(XX)發(fā)育為雄性表型，并且是可育的(Sacconeetal.,2007)。橘小實(shí)蠅Bactroceradorsalis胚胎期干擾性別決定關(guān)鍵基因tra和tra-2的表達(dá)，導(dǎo)致后代出現(xiàn)96%的雄性和4%的不能交配的不育雙性個(gè)體(Liuetal.,2015)。通過(guò)將埃及伊蚊幼蟲(chóng)浸泡在dsRNA混合物中或者飼喂表達(dá)dsRNA的細(xì)菌，干擾tra-2基因表達(dá)，導(dǎo)致后代存活率約為50%以及高達(dá)97.6%的雄性性別偏向(Hoangetal.,2016)。干擾埃及伊蚊dsx基因雌性亞型后，97%的后代為雄性表型，3%為不育雌性且喪失吸血沖動(dòng)(Whyardetal.,2015)。在岡比亞按蚊生殖細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)Yob基因獲得雄性偏向性轉(zhuǎn)基因品系，該品系后代75%為雄性，25%為雄性化的不育雌性，表現(xiàn)出生存能力降低和不同程度兩性性表型缺陷，表明通過(guò)轉(zhuǎn)基因優(yōu)化構(gòu)建能使基因型雌性完全轉(zhuǎn)化為功能性雄性(Krzywinska and Krzywinski,2018)。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除加勒比按實(shí)蠅Anastrephasuspensatra-2的表達(dá)，導(dǎo)致后代42%為雄性、47%為雙性個(gè)體、11%為雌性，而只有13%個(gè)體存活至成蟲(chóng)期，這為在加勒比按實(shí)蠅中開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)基因條件性別系統(tǒng)提供了可能(Li and Handler,2019)。Yob基因是岡比亞按蚊雄性性別決定因子，調(diào)控dsx基因雄性特異性剪切。胚胎期注射YobmRNA導(dǎo)致后代全部發(fā)育為雄性表型(Krzywinskaetal.,2016)。在埃及伊蚊中通過(guò)調(diào)控雄性決定因子Nix基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了基因型雌性向雄性表型的轉(zhuǎn)化(Aryanetal.,2019)，表明利用昆蟲(chóng)雄性決定因子的條件性表達(dá)來(lái)構(gòu)建雄性性別品系將是未來(lái)的發(fā)展方向。最近，Kandul等(2019)在黑腹果蠅中開(kāi)發(fā)出一種生產(chǎn)100%不育雄性化的系統(tǒng)，該系統(tǒng)將表達(dá)Cas9蛋白品系與同時(shí)表達(dá)β-微管蛋白基因(β-tub)和CRISPR靶標(biāo)基因sxl品系雜交，可以實(shí)現(xiàn)F1代性別分離，獲得的雄蟲(chóng)不育且具有和野生型相同的交配競(jìng)爭(zhēng)力。

4 雙翅目雌性條件性致死分離策略

雌性條件性致死通常用于獲得性別品系，而其中一部分致死系統(tǒng)是基于四環(huán)素抑制系統(tǒng)雌性特異性表達(dá)(表1)。四環(huán)素抑制系統(tǒng)的核心是四環(huán)素反式激活因子(tetracycline-repressible transactivator,tTA)，tTA是含有能序列特異識(shí)別四環(huán)素來(lái)抑制DNA結(jié)合特性的一類(lèi)融合蛋白。當(dāng)受到上游啟動(dòng)子的調(diào)控，tTA會(huì)結(jié)合到下游特異受體序列，啟動(dòng)效應(yīng)致死基因的表達(dá)。在四環(huán)素存在條件下，tTA不能結(jié)合受體，因而不會(huì)實(shí)現(xiàn)下游效應(yīng)致死基因的表達(dá)。一方面tTA調(diào)控致死基因的表達(dá)，另一方面tTA自身能夠觸發(fā)致死?；谒沫h(huán)素抑制系統(tǒng)構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因性別品系在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中飼養(yǎng)時(shí)，昆蟲(chóng)表現(xiàn)出正常的孵化率和雌雄性比。缺少四環(huán)素導(dǎo)致雌性致死，昆蟲(chóng)只有50%的孵化率且僅后代都為雄性(Schetelig and Handler,2012;Ogaugwuetal.,2013;Yanetal.,2017)。加勒比按實(shí)蠅開(kāi)發(fā)了基于四環(huán)素抑制的胚胎性別系統(tǒng)，利用胚胎特異啟動(dòng)子啟動(dòng)促凋亡細(xì)胞致死基因雌性特異表達(dá)，導(dǎo)致胚胎發(fā)育過(guò)程中雌性死亡，轉(zhuǎn)基因后代80%～100%為雄性。在大規(guī)模實(shí)驗(yàn)中，利用四環(huán)素系統(tǒng)成功孵化30 000頭轉(zhuǎn)基因胚胎，獲得100%的雄性后代，表明其可以應(yīng)用于加勒比按實(shí)蠅大規(guī)模飼養(yǎng)(Schetelig and Handler,2012)。利用tra基因性別特異性剪接調(diào)控致死基因的表達(dá)，成功構(gòu)建地中海實(shí)蠅雌性致死品系(Fuetal.,2007)。在橄欖果實(shí)蠅Bactroceraoleae建立的顯性致死釋放系統(tǒng)(RIDL)品系通過(guò)攜帶性別特異性熒光，導(dǎo)致雄蟲(chóng)不育且雌性條件性致死。通過(guò)每周釋放該轉(zhuǎn)基因品系雄蟲(chóng)，能夠在室內(nèi)試驗(yàn)中有效消除橄欖果實(shí)蠅野生種群(Antetal.,2012)。利用tra基因雌性特異性剪切和促凋亡細(xì)胞致死基因相結(jié)合的方法，成功構(gòu)建銅綠蠅Luciliacuprina和對(duì)旋麗蠅四環(huán)素抑制的雌性特異性致死系統(tǒng)(Yan and Scott,2015;Conchaetal.,2016)。其中一種對(duì)旋麗蠅目前正在接受大規(guī)模飼養(yǎng)項(xiàng)目的評(píng)估(Scottetal.,2017)。

表1 雙翅目昆蟲(chóng)性別分離方法及其機(jī)制Table 1 Sex separation methods for dipteran insects and their mechanisms

續(xù)表1 Table 1 continued

actin-4基因雌性特異性表達(dá)系統(tǒng)已在多種蚊子中用于條件性表達(dá)致死效應(yīng)因子。由于actin-4在雌性飛行相關(guān)肌肉中特異表達(dá)，條件性表達(dá)系統(tǒng)所獲得的表型是不具備飛行能力的雌性，并不會(huì)導(dǎo)致雌性致死。埃及伊蚊、白紋伊蚊和斯氏按蚊中已開(kāi)發(fā)出這樣一個(gè)系統(tǒng)，在缺少四環(huán)素的情況下導(dǎo)致無(wú)飛行能力的表型(Fuetal.,2010;Labbéetal.,2012;Marinottietal.,2013)。盡管該系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)室研究中是有效的，但是四環(huán)素會(huì)影響斯氏按蚊腸道微生物群落并損害其適應(yīng)性，導(dǎo)致在野外無(wú)意釋放的雌性斯氏按蚊更容易感染惡性瘧原蟲(chóng)(Sharmaetal.,2013)。將狄氏劑抗性等位基因易位至阿拉伯按蚊AnophelesarabiensisY染色體，導(dǎo)致雄蚊抗狄氏劑，而雌蚊對(duì)狄氏劑敏感，從而實(shí)現(xiàn)雌雄蚊分離(Yamadaetal.,2012,2013a)。Lebon等(2018)在白紋伊蚊中開(kāi)發(fā)出類(lèi)似的狄氏劑抗性品系，其性別分離效率達(dá)到98%。鑒于只有雌蚊吸食血液，在血餐中添加有毒物質(zhì)也能實(shí)現(xiàn)阿拉伯按蚊性別分離，其雌蚊在取食含伊維菌素的血餐4 d后死亡，而雄蚊取食后沒(méi)有損傷(Yamadaetal.,2013b)。由于伊維菌素隨糞便排出，導(dǎo)致所有飼養(yǎng)設(shè)備的污染，這是該系統(tǒng)用于大規(guī)模飼養(yǎng)應(yīng)用中的主要缺陷。

5 雙翅目昆蟲(chóng)可視化性別分離策略

性別自動(dòng)分離已在多種害蟲(chóng)中得到應(yīng)用(表1)，如在橘小實(shí)蠅、楊桃實(shí)蠅Bactroceracarambolae、瓜實(shí)蠅Zeugodacuscucurbitae和墨西哥實(shí)蠅中通過(guò)對(duì)蛹顏色決定基因的突變構(gòu)建了遺傳性別品系(GSS) (McInnisetal.,2004;Isasawinetal.,2012,2014;Zepeda-Cisnerosetal.,2014)。通過(guò)該方法能達(dá)到100%性別分離，在田間試驗(yàn)中，這些遺傳性別品系表現(xiàn)出良好的競(jìng)爭(zhēng)力(McInnisetal.,2007;Isasawinetal.,2012;Orozco-Dávilaetal.,2015)。由于突變與染色體易位相關(guān)，品系中的個(gè)體是半不育的。在難以發(fā)現(xiàn)或調(diào)控顏色突變的情況下，利用性別特異性啟動(dòng)子調(diào)控?zé)晒鈽?biāo)記蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)性別分離是可行的。在斯氏按蚊、埃及伊蚊和阿拉伯按蚊中，利用與β2-微管蛋白基因啟動(dòng)子連鎖的標(biāo)記實(shí)現(xiàn)了蚊蟲(chóng)晚期幼蟲(chóng)和蛹階段的性別分離(Catterucciaetal.,2005;Smithetal.,2007;Nolanetal.,2011)。Condon等(2007)在地中海實(shí)蠅幼蟲(chóng)晚期階段建立了兩個(gè)高熒光表達(dá)的轉(zhuǎn)基因性別品系，其蛹的性別自動(dòng)篩選分離準(zhǔn)確率為97.5%～100%。

利用岡比亞按蚊精子特異性β2-微管蛋白啟動(dòng)子表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)，從而在4齡幼蟲(chóng)階段將雄蚊分離(Catterucciaetal.,2005)。Magnusson等(2011)在岡比亞按蚊1齡幼蟲(chóng)階段開(kāi)發(fā)出另一種性別分離標(biāo)記，該品系的雄蟲(chóng)攜帶含有雌性特異性dsx基因內(nèi)含子的EGFP報(bào)告基因，由于dsx基因進(jìn)行雄性特異剪切使得EGFP報(bào)告基因得以表達(dá)。而將綠色熒光蛋白(GFP)插入岡比亞按蚊Y染色體，雄蚊表達(dá)綠色熒光蛋白，而雌蚊表達(dá)紅色熒光蛋白(Bernardinietal.,2014)。攜帶X染色體標(biāo)記的性別品系和攜帶Y染色體標(biāo)記的性別品系通過(guò)雜交產(chǎn)生非轉(zhuǎn)基因的雄蚊種群，從而在避免釋放轉(zhuǎn)基因品系的前提下將雄蚊分離出來(lái)。此外，Bernardini等(2017)通過(guò)種間雜交將岡比亞按蚊Y染色體表達(dá)的熒光標(biāo)記滲入阿拉伯按蚊。在銅綠蠅中開(kāi)發(fā)了一種在雌性幼蟲(chóng)中過(guò)表達(dá)熒光標(biāo)記報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因品系，從而實(shí)現(xiàn)早期幼蟲(chóng)性別分離(Lietal.,2014)。

基于成像技術(shù)的非轉(zhuǎn)基因性別分離策略也在開(kāi)發(fā)中，并且在基因改造受限制的物種中得到應(yīng)用(表1)。利用基于雌雄性別二態(tài)性的近紅外(NIR)成像技術(shù)能對(duì)野生型白足舌蠅Glossinapallidipes(WT)蛹進(jìn)行性別分離，且準(zhǔn)確率為80%～100% (Dowelletal.,2005;Moran and Parker,2016)。結(jié)合性別二態(tài)性和成像技術(shù)對(duì)多種按蚊和伊蚊開(kāi)發(fā)出雌雄蛹自動(dòng)分揀器，其雌蚊污染率小于1%。對(duì)阿拉伯按蚊的分揀效率不高，但對(duì)伊蚊的分揀能實(shí)現(xiàn)65%～98%的雄蚊恢復(fù)，展示出其優(yōu)異的性能(Zacarésetal.,2018)。基于白紋伊蚊雌雄蚊化蛹時(shí)間的差異，Bellini等(2018)開(kāi)發(fā)出一種新的非轉(zhuǎn)基因性別分離方法，他們經(jīng)過(guò)10代的雌雄蚊化蛹時(shí)間的差異篩選出雌蚊和雄蚊的品系，該品系28%的早期蛹中99%為雄蚊。該系統(tǒng)表明其他表型可以作為基于遺傳操作的性別分離策略的未來(lái)研究方向。

6 小結(jié)與展望

盡管昆蟲(chóng)不育技術(shù)(SIT)在害蟲(chóng)防治中已使用長(zhǎng)達(dá)60年，但并未被公眾廣泛熟知，尤其是在攜帶致病菌的種群之中。對(duì)正在防治白紋伊蚊試驗(yàn)的法國(guó)La Reunion島上居民進(jìn)行的一項(xiàng)民意調(diào)查顯示，只有34%的居民了解昆蟲(chóng)不育技術(shù)。當(dāng)獲悉昆蟲(chóng)不育技術(shù)的應(yīng)用原則時(shí)，61%的人支持釋放野生型輻照不育雄性。相較于利用雌雄性二態(tài)特征，釋放基因改造過(guò)的蚊蟲(chóng)面臨更多反對(duì)意見(jiàn)。由于公眾缺少SIT相關(guān)專(zhuān)業(yè)知識(shí)所引起的擔(dān)憂，導(dǎo)致一些害蟲(chóng)防治項(xiàng)目被迫取消(Panjwani and Wilson,2016)。Antonelli等(2015)發(fā)現(xiàn)，公眾輿論對(duì)轉(zhuǎn)基因蚊蟲(chóng)不同術(shù)語(yǔ)的態(tài)度各不相同。即使是遺傳狀態(tài)相關(guān)性不高的不育昆蟲(chóng)，釋放轉(zhuǎn)基因品系比釋放通過(guò)傳統(tǒng)方法突變獲得的品系更令人擔(dān)憂。當(dāng)Oxitec公司在加勒比地區(qū)進(jìn)行田間試驗(yàn)釋放轉(zhuǎn)基因蚊蟲(chóng)時(shí)，科學(xué)界本身也提出了擔(dān)憂(Phucetal.,2007;Antonellietal.,2015;Panjwani and Wilson,2016)。相似的情況是，一些政府反對(duì)在其領(lǐng)土上釋放轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)，因而科學(xué)家們?cè)陂_(kāi)發(fā)昆蟲(chóng)不育新技術(shù)時(shí)不得不考慮以上種種擔(dān)憂。

雌性條件性致死系統(tǒng)雖然無(wú)需初始成本，但仍需化學(xué)藥劑如狄氏劑、四環(huán)素的日常處理成本以及處理污染的飼養(yǎng)用水。由于雌蚊能叮咬并傳播病原菌，因此規(guī)?；男詣e分離方案必須使雌性移除率達(dá)到99%以上。大多數(shù)早期和晚期性別分離方法都依賴(lài)于轉(zhuǎn)基因技術(shù)。基于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的性別分離策略的飼養(yǎng)成本效率是可觀的，但由于公眾消極認(rèn)知或監(jiān)管禁令導(dǎo)致其實(shí)際應(yīng)用受到限制。盡管伊蚊蛹分揀機(jī)和白足舌蠅近紅外成像的發(fā)展速度和成本受到抑制，但是這兩種技術(shù)仍不失為一種切實(shí)可行的方案(Moran and Parker,2016;Zacarésetal.,2018)。當(dāng)必須規(guī)避轉(zhuǎn)基因方法時(shí)，基于蛹顏色相關(guān)等位基因如stripe或redeye突變的傳統(tǒng)遺傳性別品系(genetic sexing strains,GSS) (McInnisetal.,2004;Isasawinetal.,2012,2014)，對(duì)雌雄蛹的自動(dòng)分離是行之有效的(Seawrightetal.,1982;Mukiama,1985)。最近，Ndo等(2018)在按蚊中分離出一種溫度致死性突變，也可用于構(gòu)建其遺傳性別品系。在允許使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)的情況下，利用四環(huán)素反式激活因子(tTA)調(diào)控促凋亡基因的表達(dá)能夠?qū)е露喾N害蟲(chóng)早期發(fā)育階段雌性特異性致死(Schetelig and Handler,2012;Ogaugwuetal.,2013;Yanetal.,2017)。發(fā)育晚期性別分離策略雌雄分離階段偏晚，但是結(jié)合釋放攜帶顯性致死的昆蟲(chóng)不育技術(shù)(RIDL)可以實(shí)現(xiàn)釋放的雌性幼蟲(chóng)在死亡前和野生幼蟲(chóng)競(jìng)爭(zhēng)食物和空間，從而提高害蟲(chóng)防治效率。當(dāng)釋放同等競(jìng)爭(zhēng)力和同等數(shù)量的昆蟲(chóng)時(shí)，RIDL系統(tǒng)比傳統(tǒng)昆蟲(chóng)不育技術(shù)(SIT)更有效(Blacketal.,2011)。在本綜述中，我們沒(méi)有對(duì)X染色體斷裂系統(tǒng)導(dǎo)致的性比失衡(Galizietal.,2014,2016)進(jìn)行討論，是由于這個(gè)品系產(chǎn)生的是非條件性雄性性別偏向種群。但是X染色體斷裂系統(tǒng)對(duì)于大規(guī)模室內(nèi)試驗(yàn)中遺傳調(diào)控仍是十分有效的(Facchinellietal.,2019)。如果這種性比失衡品系可以實(shí)現(xiàn)規(guī)模化飼養(yǎng)，其釋放效率可比SIT高16～3 000倍，比RIDL高2～70倍(Schliekelmanetal.,2005)。

雙翅目雌雄性別分離在過(guò)去15年中受到了諸多關(guān)注，提出的包括性比失衡、雌性條件性致死和昆蟲(chóng)可視化性別分離策略由于分離效率的差異，其防治效果高低不一。性別分離策略中分離技術(shù)、治理成本和品系特征等因素會(huì)影響公眾和政府對(duì)實(shí)施這些害蟲(chóng)不育防治技術(shù)的可行性和可接受性。性別分離新策略不僅需要滿足分離效率要求，而且還需滿足社會(huì)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。近年來(lái)相繼在埃及伊蚊、岡比亞按蚊、斯氏按蚊、家蠅和地中海實(shí)蠅中鑒定出雄性性別決定基因Nix,Yob,Guy1,Mdmd和MoY，極大豐富和完善了雙翅目昆蟲(chóng)性別決定和分化分子機(jī)制，通過(guò)對(duì)這些雄性決定基因改造改變昆蟲(chóng)性別，使其性別分化向著有利于人類(lèi)的方向發(fā)育，如：使害蟲(chóng)種群全部產(chǎn)生雄性后代，導(dǎo)致其不能繁衍，發(fā)展不依賴(lài)輻射處理的昆蟲(chóng)不育防治技術(shù)(SIT)；或使天敵種群全部產(chǎn)生雌性后代，擴(kuò)大害蟲(chóng)天敵的種群數(shù)量，為害蟲(chóng)天敵的遺傳改良提供有效途徑。特別是發(fā)展基于CRISPR/Cas9的基因驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)進(jìn)行害蟲(chóng)性別分離，將加快害蟲(chóng)遺傳調(diào)控和不育防治技術(shù)的發(fā)展。