纖維素酶果膠酶輔助提取西瓜番茄紅素工藝優(yōu)化

劉義慶，王春燕，胡思前

（1.江漢大學化學與環(huán)境工程學院，湖北武漢 430056；2.華中農業(yè)大學食品科學技術學院，湖北武漢 430070；3.中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，山東濟南 250014）

西瓜是深受人們喜愛的夏季時令水果，具有清熱解暑、生津止渴、利尿除煩之功效，營養(yǎng)豐富，食用安全，又有良好的保健作用，堪稱“盛夏之王”[1]。據統(tǒng)計，2018 年我國西瓜種植面積約152 萬hm2，年總產量約8 200 萬t，約占我國瓜類作物種植面積的71.7%，是夏季消暑水果[2]。

番茄紅素是西瓜中重要的生理活性物質，具有消除自由基、預防心血管疾病、降血糖、促進細胞間的連接與傳導、防癌抗癌、提高免疫力等多種生理功能[3]，因此提取與制備番茄紅素是人們研究的熱點[4-6]。西瓜中番茄紅素含量高，且無需加工就可直接被人體吸收，所以西瓜是番茄紅素的良好來源[7]。西瓜中番茄紅素的提取方法主要有有機溶劑浸提法[7]、酶輔助溶劑萃取法[8]、超聲波輔助萃取法[9]、微波輔助萃取法[10]、微波超聲聯(lián)合輔助萃取法[11]等。其中，酶輔助提取應用較廣泛，常用于色素及各類生物活性物質的提取。與其它提取方法相比，具有儀器簡單、操作方便、成本低、投資少，提取效率高的特點[12-13]。雖然有酶法輔助提取番茄紅素的報道，但酶輔助提取西瓜番茄紅素的探索不夠深入，特別是纖維素酶、果膠酶對西瓜果肉的酶解作用條件和兩種酶的最佳用量比等值得作進一步研究。本文分析了纖維素酶、果膠酶對西瓜酶解作用的條件，通過試驗確定了纖維素酶、果膠酶聯(lián)合輔助提取西瓜番茄紅素的酶用量比，并通過正交試驗篩選出了復合酶聯(lián)合輔助提取西瓜番茄紅素的最佳工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西瓜品種為華欣，購于武漢郭徐嶺菜市場。

纖維素酶（酶活50 000 U/g）、果膠酶（酶活30 000 U/g），上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；石油醚、乙酸乙酯、丙酮均為分析純，天津市福晨化學試劑廠；醋酸、醋酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；實驗室用水均為去離子水。

1.2 儀器與設備

722E 型可見光光度計，上海光譜儀器有限公司；JY3002 電子天平，上海精密科學儀器有限公司；HH-2 型數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；PHS-2C 型精密酸度計，上海精科雷磁；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，鞏義予華儀器有限責任公司；電烘箱，上海福瑪實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料預處理

西瓜洗凈，去皮切塊，絞碎，過濾除汁，向西瓜果肉中，加入適量甲醇浸泡脫水，避光靜置4 h 后抽濾，將抽濾后的西瓜果肉置于干燥箱內，在60 ℃下低溫干燥4 h后取出，密封貯于5 ℃冰箱中備用。

1.3.2 西瓜番茄紅素最大吸收波長的確定

稱取2 g 西瓜果肉樣品，置于10 mL 帶塞比色管中，加入10 mL 乙酸乙酯-丙酮混合溶劑（7：1，V/V），在室溫下浸提1 h，取適量上層提取液在比色管中稀釋定容至10 mL，用分光光度計測定西瓜番茄紅素溶液的吸收光譜。

1.3.3 西瓜番茄紅素提取試驗方法

稱取西瓜果肉樣品5 g，置于100 mL 帶塞錐形瓶中，加入一定量的酶，在一定溫度和pH 條件下酶解一定時間，根據文獻[9]，采用乙酸乙酯-丙酮為提取溶劑（7：1，V/V），加入25 mL 提取溶劑，提取一定時間。靜置，取一定量上層提取液用提取劑稀釋定容至10 mL，以提取劑作參比，用分光光度計測溶液吸光度，計算提取量。每個試驗重復3 次，取平均值。

1.3.4 番茄紅素提取率的確定

稱取西瓜果肉樣品5 g，置于100 mL 帶塞錐形瓶中，加入25 mL 提取溶劑，重復提取3～5 次至提取完全，合并提取液，采用文獻[14]的方法制作工作曲線，根據式（1）計算5 g 西瓜果肉樣品含番茄紅素的總質量，然后根據式（2）計算提取率。

式中，m0-番茄紅素總質量，μg；c0-番茄紅素的質量濃度，μg/mL；V0-定容的體積，mL；N0-稀釋倍數；Y-提取率，%；m-提取液番茄紅素的質量，μg；c-提取液中番茄紅素的濃度，μg/mL；V-定容的體積，mL。

1.3.5 酶輔助提取單因素試驗

稱取若干份經預處理后的西瓜果肉樣品于100 mL帶塞錐形瓶中，每份5 g，分別研究酶用量、酶解溫度、酶解時間和酸堿度對西瓜番茄紅素提取率的影響。設置酶用量為西瓜果肉質量的0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，酶解溫度為35、40、45、50、55、60 ℃，酶作用pH 為3、4、5、6、7、8，酶解時間為1、2、3、4、5 h。每個試驗重復3 次，取平均值。

1.3.6 單一酶與混合酶對西瓜番茄紅素提取率的影響比較

稱取9 份經預處理的西瓜果肉樣品于100 mL 帶塞錐形瓶中，每份5 g，分為3 組，分別試驗纖維素酶、果膠酶、復合酶對西瓜番茄紅素提取率的影響。復合酶的構成比例和用量根據1.3.5 的試驗結果確定。固定酶解溫度、溶液pH 和酶解時間，用提取劑提取，比較不同的加酶方案對西瓜番茄紅素提取效率的影響。

1.3.7 酶輔助提取正交試驗

影響酶法提取番茄紅素的因素有酶添加量、酶解溫度、溶液pH、酶解時間。為了比較各因素對提取率的影響程度，在單因素試驗的基礎上進行正交試驗。

2 結果與分析

2.1 西瓜番茄紅素的吸收光譜

西瓜番茄紅素的吸收光譜見圖1。由圖1 可知，番茄紅素在455、481 nm 處各有一個吸收峰，其中以481 nm處吸收強度最大，檢測靈敏度最高。結合文獻[9]報道，故選用481 nm 作為番茄紅素含量的測定波長。

2.2 酶添加量對西瓜番茄紅素提取率的影響

酶添加量對提取番茄紅素的影響見圖2。由圖2 可知，隨著纖維素酶添加量的增加，西瓜番茄紅素提取液的吸光度先增加后減少，當纖維素酶的添加量為西瓜果肉質量的0.4%時，溶液的吸光度最大，提取效率最高，與其它比例的酶添加量相比具有顯著性差異（P＜0.05）。因此，纖維素酶的最佳添加量為西瓜果肉質量的0.4%。

隨著果膠酶添加量的增加，西瓜番茄紅素提取液的吸光度先增加后減少，當果膠酶添加量為西瓜果肉質量的0.10%時，溶液的吸光度最大，提取效率最高，與其它比例酶添加量相比具有顯著性差異（P＜0.05）。因此，果膠酶最佳添加量為西瓜果肉質量的0.1%。

2.3 酶解溫度對西瓜番茄紅素提取率的影響

酶解溫度對番茄紅素提取率的影響見圖3。由圖可知，從35 ℃開始，隨著果膠酶酶解溫度的升高，西瓜番茄紅素提取液的吸光度先增加后減少，溫度為50 ℃時吸光度最大，番茄紅素的提取率最大，與其它溫度下的提取率相比差異顯著（P＜0.05）。因此，果膠酶的最佳作用溫度為50 ℃。

隨著溫度的升高，經纖維素酶酶解作用的西瓜番茄紅素提取液吸光度也呈先增加后下降的趨勢。溫度為55 ℃時，番茄紅素提取液吸光度最大，提取率最高，與其它溫度下的提取率相比差異顯著（P＜0.05）。因此，纖維素酶的最佳作用溫度為55 ℃。

2.4 酶作用時間對西瓜番茄紅素提取率的影響

纖維素酶、果膠酶酶解時間對番茄紅素提取率的影響見圖4（見下頁）。由圖4 可知，隨著纖維素酶作用時間的增加，西瓜番茄紅素提取液的吸光度增加，作用時間為3 h 時，溶液的吸光度最大，提取率最高，與其它作用時間相比差異顯著（P＜0.05）。繼續(xù)增加酶作用時間，番茄紅素提取率不變，因此，纖維素酶的最佳作用時間為3 h。

隨著果膠酶作用時間的增加，西瓜番茄紅素提取液的吸光度增加，果膠酶的作用時間為2 h 時，溶液的吸光度最大，提取率最高，與其它作用時間的提取率相比差異顯著（P＜0.05）。繼續(xù)增加酶作用時間，番茄紅素提取率有所下降，所以果膠酶的最佳作用時間為2 h。

2.5 pH 值對西瓜番茄紅素提取率的影響

溶液酸堿度對番茄紅素提取率的影響見圖5。由圖5可知，隨著纖維素酶酶解pH 的增加，西瓜番茄紅素提取液的吸光度增加，纖維素酶的酶解pH 為5.0 時，溶液的吸光度最大，提取率最高，與其它pH 條件下的提取率相比差異顯著（P＜0.05）。因此，纖維素酶的最佳酶解pH 為5.0。

隨著果膠酶酶解pH 的增加，西瓜番茄紅素提取液的吸光度增加，果膠酶的酶解pH 為4.0 時，溶液的吸光度最大，提取率最高，與其它pH 的提取相比差異顯著（P＜0.05）。所以果膠酶的最佳酶解pH 為4.0。

2.6 混合酶組成比例及不同加酶方案對提取西瓜番茄紅素提取率的影響比較

根據2.2 的試驗結果確定質量比為4：1 的纖維素酶、果膠酶組成復合酶。單一酶和混合酶對提取番茄紅素的影響見圖6。由圖6 可知，單一酶和混合酶均可使西瓜番茄紅素的提取率增加，但不同的加酶方案對提取番茄紅素的影響不同：添加0.10%果膠酶與不加酶相比可使溶液吸光度增加16.1%；添加0.40%的纖維素酶與不加酶相比可使溶液吸光度增加41.3%，而添加0.50%混合酶時提取番茄紅素的效果最佳，可使溶液吸光度增加54.8%。

2.7 正交試驗

根據單因素試驗結果，添加0.50%的混合酶（果膠酶和纖維素酶質量比為1：4）時提取番茄紅素的效果最佳。纖維素酶、果膠酶的最佳作用溫度分別為55、50 ℃，纖維素酶的最佳作用時間為3 h，果膠酶的最佳作用時間為2 h，纖維素酶的最佳酶解pH 為5.0，果膠酶的最佳酶解pH 為4.0。因此，選擇對西瓜番茄紅素提取影響較大的四個因素，即混合酶量、酶解溫度、酶解pH 和酶解時間，設計四因素四水平正交試驗方案（見表1），以西瓜番茄紅素提取率為衡量指標優(yōu)化提取工藝。試驗結果如表2 所示。

表1 酶法提取西瓜番茄紅素正交試驗設計Table 1 Orthogonal experiment design of enzymatic extraction of lycopene from watermelon

表2 正交試驗結果Table 2 The results of orthogonal test

由表2 可知，利用混合酶酶解提取番茄紅素時，四因素的影響大小順序為A＞C＞D＞B，可見酶添加量對提取西瓜番茄紅素的影響最大，然后是pH 值，其次是反應時間，最后是溫度。極差分析最佳組合為A3B3C2D2，所以酶解法提取西瓜番茄紅素的最佳工藝為質量比4：1 的纖維素酶、果膠酶混合酶添加量0.6%，酶解溫度55 ℃，酶解pH 值4.5，酶解時間2 h。

經驗證，在此條件下西瓜番茄紅素的提取率為91%，說明酶輔助法可以大幅度提高番茄紅素的提取率。

3 結論

添加纖維素酶、果膠酶及由纖維素酶、果膠酶組成的混合酶對提取西瓜番茄紅素均有顯著性影響，以添加混合酶（纖維素酶、果膠酶質量比為4：1）時提取西瓜番茄紅素的效果最佳。同時酶的添加量，酶解pH，酶解溫度，酶解時間都對提取效率有直接明顯作用。正交試驗結果表明，混合酶酶解各影響因素的影響順序為混合酶量＞酶解pH＞酶解時間＞酶解溫度?；旌厦该附庾罴压に嚍榧踊旌厦噶?.6%，酶解溫度55 ℃，酶解pH 值4.5，酶解時間2.0 h，此條件下西瓜番茄紅素的提取率可達到91%。