HPLC法測定芪歸益母膏中芍藥苷的含量

冉麗娟，曾珍，黎昌權(quán)

（重慶市萬州食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 萬州 404000）

芪歸益母膏是重慶市萬州區(qū)中醫(yī)院在多年臨床治療、應(yīng)用過程中總結(jié)研發(fā)的自制制劑，處方由黃芪、當(dāng)歸、益母草、白芍等四味中藥組成，具有益氣養(yǎng)血、調(diào)經(jīng)止痛的作用，臨床上用于月經(jīng)不調(diào)及痛經(jīng)等，臨床應(yīng)用效果滿意。該制劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只有通則檢查和薄層色譜鑒別試驗(yàn)，白芍在該制劑中為臣藥，其指標(biāo)成分明確，《中國藥典》2015年版一部［1］將芍藥苷作為白芍定量分析的指標(biāo)之一。本文采用高效液相色譜法對芪歸益母膏中白芍所含活性成分芍藥苷的含量進(jìn)行了方法學(xué)研究，為該制劑的質(zhì)量控制提供了定量檢測方法。

1 儀器與試藥

島津LC-20A高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器，LCsolution色譜工作站。Sartorius型號為CP224S電子天平 （Max 210 g；d＝0.1 mg）、Sartorius型號為ME215S電子天平 （Max 210 g；d＝0.01 mg），分液漏斗，0.45μm微孔濾膜。

芍藥苷對照品 （購買自中國食品藥品檢定研究院，批號：110736-201842，含量以97.4%計(jì)，使用前無需處理，供含量測定用），芪歸益母膏 （重慶市萬州區(qū)中醫(yī)院提供，批號：20190605、20190829、20191029），正丁醇、乙醇、磷酸等均為分析純，乙腈為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［2-3］

色譜柱：InertSustainC18柱5μ（250 mm×4.6 mm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸 （15∶85）；流速：1.0 mL／min；檢測波長：230nm；進(jìn)樣量：20μL。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取芍藥苷對照品14.19mg，置50mL量瓶中，加稀乙醇適量，超聲處理15min使溶解，放冷，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。精密量取對照品貯備液3.00mL，置10mL量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液制備

取本品適量，混勻，精密稱取1.0g，置分液漏斗中，加水30mL溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次30mL，合并正丁醇提取液，然后余液再用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次30mL。最后所得正丁醇液置蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干，殘?jiān)酉∫掖?0mL溶解并定容至25mL量瓶中，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性供試品溶液的制備

按處方 （不含白芍）及本品工藝制備供試品，按 “2.3”項(xiàng)方法處理即得陰性供試品溶液。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別取對照品溶液、供試品溶液及陰性供試品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，色譜條件同上。記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。圖1可得出，在此條件下，陰性供試品對芍藥苷的測定無干擾，而且芍藥苷和其他成分可達(dá)到基線分離，分離度R＞1.5。

圖1 芪歸益母膏HPLC圖譜

2.6 線性關(guān)系考察

分別精密量取 “2.2”項(xiàng)下的對照品貯備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，置10mL量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，在上述色譜條件下，進(jìn)樣量為20μL進(jìn)行測定，記錄色譜圖，以峰面積A與芍藥苷對照品的濃度C（mg／mL）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為：A＝1.373×104C+2.037，r＝0.999 9。表明芍藥苷在0.0276～0.1382mg·mL-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取對照品溶液20μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，最后RSD為0.52%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批次制得的供試品溶液20μL，分別于0，2，4，6，8，12，24 h進(jìn)樣1次，記錄色譜圖得到峰面積，芍藥苷峰面積的RSD為0.56%，保留時間基本不變。表明供試品溶液在24 h是穩(wěn)定的。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號供試品，制備6份供試品溶液，分別測定芍藥苷的含量，得其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.027mg／g，RSD為0.85%。表明本方法重復(fù)性良好。

2.10 回收率試驗(yàn)

稱取已得含量的供試品9份，每份1.0g，分別精密加 “2.2”項(xiàng)下的對照品貯備液2、3、4mL（各3份），均按 “2.3”項(xiàng)下的方法處理，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n＝9）

2.11 供試品測定

分別取3批次供試品，按 “2.3”項(xiàng)下的方法制備得到3批供試品溶液，精密量取20μL，測定，每批同時測定3次，按外標(biāo)法計(jì)算芍藥苷的含量，結(jié)果見表2。

表2 供試品含量測定結(jié)果 （n＝3）

3 討論

1）波長的選擇，取供試品液用紫外檢測器，在200～400nm掃描，結(jié)果在230nm波長處，芍藥苷的吸光度最大，故選用230 nm作為檢測波長。

2）流動相的選擇［2-3］，用不同比例的乙腈-0.05mol／L磷酸氫二鉀溶液和不同比例的乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，乙腈-0.1%磷酸 （15∶85）為流動相時，芍藥苷峰形對稱，分離完全，陰性供試品無干擾，且理論板數(shù)高，拖尾因子小，故作為該試驗(yàn)流動相。

3）在芪歸益母膏現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，僅有通則檢查和鑒別試驗(yàn)。據(jù)了解芪歸益母膏在該院卻廣泛用于臨床，療效明確，為有效地控制藥品質(zhì)量，建議增加芪歸益母膏的定量檢測。

4）采用HPLC測定芪歸益母膏中芍藥苷的含量，受主客觀因素的干擾較小，且準(zhǔn)確、簡便、重復(fù)性好，可作為芪歸益母膏的定量分析方法。