馬度米星銨對鯽魚肝臟細(xì)胞色素P450酶系的影響

楊丹,宋昕昊,季春雷,彭麟,高修歌,左儒楠,季輝,江善祥

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

馬度米星銨是一種聚醚類離子載體抗生素,因其具備廣譜抗球蟲作用、效價(jià)高、低耐藥性等特點(diǎn)被用于防治雞球蟲病[1-2]。馬度米星銨在雞體內(nèi)代謝較快且不會被完全代謝,部分以原形藥物形式通過雞糞進(jìn)入土壤中,進(jìn)一步污染水體生態(tài)環(huán)境,對人類和水生生物構(gòu)成潛在威脅[3]。有文獻(xiàn)報(bào)道[4],在西班牙地表水中檢測到馬度米星銨的存在,平均質(zhì)量濃度為13.2 ng·L-1。已有研究表明,2.5 mg·L-1的馬度米星銨會損傷斑馬魚的鰓、肝臟和腸道等主要器官[5]。食用殘留有馬度米星銨的動物組織能引起人肌肉疼痛、心臟冠狀動脈擴(kuò)張、肝腎功能受損等癥狀,對人類健康造成嚴(yán)重影響[6]。

細(xì)胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)酶系是一類亞鐵血紅素蛋白的超家族酶系,主要分布在肝臟,參與多種內(nèi)源物質(zhì)(保幼激素及其類似物、蛻皮甾酮、脂肪酸和信息素等)和外源物質(zhì)(藥物、環(huán)境毒物等)在生物體內(nèi)的代謝,在解毒酶系中占有重要位置[7]。由于CYP450酶系同工酶對外源性物質(zhì)的高敏感性,已將其作為早期評估和檢測水生生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)污染的重要指標(biāo)[8]。在CYP450酶系中,CYP1～4亞家族在代謝外源性物質(zhì)的過程中發(fā)揮重要作用,它的活性變化可能對動物食品的藥物殘留產(chǎn)生重要影響[9]。

鯽魚是我國最常見的淡水魚類之一[10]。鯽魚在水生生態(tài)系統(tǒng)食物鏈中具有非常重要的位置,因?yàn)槠鋵λw環(huán)境的高度敏感性,在毒理學(xué)和評價(jià)生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)等方面發(fā)揮了重要作用[8,11]。本文以鯽魚為試驗(yàn)動物,從基因、酶活性和體外肝微粒體孵育3個(gè)方向研究馬度米星銨對鯽魚肝臟CYP450酶系的影響,篩選出敏感的生化指標(biāo)作為馬度米星銨污染水體的生物標(biāo)志物,為生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估提供物質(zhì)基礎(chǔ);同時(shí)初步探討其毒性機(jī)制,為進(jìn)一步研究馬度米星銨在肝臟中的代謝提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物及試驗(yàn)動物

馬度米星銨:含量91.9%,生產(chǎn)批號1701004,浙江匯能生物股份有限公司。

試驗(yàn)鯽魚平均體質(zhì)量為(289±25)g,購于南京特給力種植專業(yè)合作社,置于聚乙烯塑料箱(60 cm×40 cm×30 cm)內(nèi)。水源為充分曝氣脫氯的自來水,試驗(yàn)期間不間斷充氧,水中溶氧量大于6 mg·L-1,pH值約為7,水溫(20±2)℃,保持12 h∶12 h的光暗周期。每天更換一半養(yǎng)殖用水并將藥物補(bǔ)充至初始濃度。按鯽魚體質(zhì)量的1%定時(shí)投喂不含抗生素的全價(jià)魚飼料并清理箱底糞便及剩余飼料。試驗(yàn)前馴養(yǎng)1周,自然死亡率低于1%。

1.2 主要試劑和儀器

乙醇、氯化鉀和三氯甲烷均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;RNAiso Plus、TB GreenPremixExTaqⅡ和PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser均購于寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司;檢測紅霉素-N-脫甲基酶(ERND)、7-乙氧基異吩唑酮-脫乙基酶(EROD)、氨基比林-N-脫甲基酶(APND)、NADPH-細(xì)胞色素C還原酶(NCCR)、苯胺-4-羥化酶(AH)的活性和CYP450含量的試劑盒均購于上海江萊生物科技有限公司;微量紫外分光光度計(jì)(NanoDrop 2000型)、高效液相色譜儀(UltiMate 3000),美國Thermo Fisher;熒光定量PCR儀(CFX96型)、微型電動勻漿器(1658050型),美國BIO-RAD;多功能酶標(biāo)儀(Infinite 200 PRO),瑞士Tecan。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)分組處理采用半靜態(tài)染毒法,試驗(yàn)時(shí)長28 d,設(shè)定低劑量組(0.112 mg·L-1)、中劑量組(0.224 mg·L-1)、高劑量組(0.448 mg·L-1)及助溶劑(乙醇)對照組。鯽魚處死前禁食1 d,分別于染毒后7、14、21和28 d從各組隨機(jī)取4條,頭部穿刺致死,立即取出肝臟,用冰冷的0.15 mol·L-1KCl溶液反復(fù)漂洗除去紅細(xì)胞,濾紙吸干多余水分,置于液氮冷凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃保存。

1.3.2 RT-qPCR檢測CYP450酶系相關(guān)基因表達(dá)使用RNAiso Plus試劑提取肝臟總RNA并檢測其完整性。采用微量分光光度計(jì)確定總RNA濃度和純度(1.8

表1 熒光定量PCR的引物序列

1.3.3 鯽魚肝CYP450酶系生化指標(biāo)測定取肝組織,按1∶9的質(zhì)量體積比添加預(yù)冷的勻漿液(0.25 mol·L-1蔗糖、0.01 mol·L-1Tris、1 mmol·L-1EDTA,pH7.4),用勻漿機(jī)冰水浴中勻漿,4 ℃、13 000g離心20 min,取上清液立即檢測。ERND、EROD和APND等指標(biāo)測定均按試劑盒說明書的步驟進(jìn)行。

1.3.4 對乙酰氨基酚濃度的HPLC檢測[13]1)色譜條件。色譜柱:Waters Sunfire C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),流速0.5～0.8 mL·min-1,檢測波長254 nm,柱溫40 ℃,進(jìn)樣量100 μL,以甲醇(A)和水(B)為流動相,V(A)∶V(B)依次為20∶80、40∶60、20∶80,采用梯度洗脫程序。洗脫條件見表2。2)對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線。以對乙酰氨基酚和內(nèi)標(biāo)(安替比林)峰面積的比值為縱坐標(biāo)(Y)對對乙酰氨基酚濃度(X)進(jìn)行線性回歸,得出對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

表2 對乙酰氨基酚的梯度洗脫條件

1.3.5 鈣離子沉淀法制備肝微粒體[14]取空白鯽魚肝組織,按1∶4的質(zhì)量體積比添加預(yù)冷的勻漿液,用勻漿機(jī)冰水浴中勻漿,4 ℃、19 000g離心20 min,將1 mL上清液加入0.1 mL 88 mmol·L-1CaCl2溶液,冰浴放置10 min,期間輕輕混勻數(shù)次,再于4 ℃、27 000g離心 20 min,向沉淀中加入4倍于肝質(zhì)量的勻漿液,于4 ℃、27 000g離心20 min,粉紅色沉淀即為所需的肝微粒體。將沉淀重懸于含20%甘油的懸浮緩沖液(0.25 mol·L-1KCl、0.01 mol·L-1Tris、1 mmol·L-1EDTA,pH7.4)中,分裝,置-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用Bradford法測定肝微粒體中的蛋白濃度[15]。

1.3.6 體外肝微粒體孵育條件及樣品處理孵育體系包括:1 mg·mL-1肝微粒體、133 μmol·L-1非那西丁、1 mmol·L-1NADPH、50 mmol·L-1Tris-HCl(pH7.4),補(bǔ)足體系至600 μL。20 ℃預(yù)孵10 min,加入NADPH啟動反應(yīng)后再孵育20 min。反應(yīng)體系中有機(jī)溶劑少于1%。待反應(yīng)結(jié)束后加入150 μL冰冷的甲醇(含內(nèi)標(biāo)安替比林)終止反應(yīng)并沉淀蛋白。渦旋振蕩,13 000g離心10 min,吸100 μL上清液進(jìn)行HPLC測定。

1.3.7 優(yōu)化體外肝微粒體孵育條件根據(jù)肝微粒體孵育活性的影響因素,對肝微粒體蛋白質(zhì)量濃度(0.2、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·mL-1)、孵育時(shí)間(10、20、30、60、90和120 min)及孵育溫度(0、4、10、20、37和45 ℃)分別進(jìn)行優(yōu)化。分別以肝微粒體蛋白質(zhì)量濃度、孵育時(shí)間及孵育溫度為橫坐標(biāo)(X),以對乙酰氨基酚生成率為縱坐標(biāo)(Y),選擇線性范圍內(nèi)比值最高點(diǎn)作為最佳孵育條件。

1.3.8 馬度米星銨對鯽魚肝微粒體中CYP1A活性的影響向孵育體系中分別加入馬度米星銨使其終濃度為1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00 μmol·L-1,采用優(yōu)化后指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn),其他條件不變。按如下公式計(jì)算馬度米星銨對CYP1A活性的抑制率,以馬度米星銨濃度和抑制率為橫、縱坐標(biāo),繪制“馬度米星銨濃度-抑制率”曲線圖。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 馬度米星銨對鯽魚肝CYP450酶系相關(guān)基因表達(dá)的影響

染毒后7 d,0.448 mg·L-1馬度米星銨組CYP1AmRNA表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05);染毒后14和21 d,0.112 mg·L-1馬度米星銨組CYP1AmRNA表達(dá)量顯著高于對照組(圖1-A)。染毒后7 d,0.224 mg·L-1馬度米星銨組CYP3AmRNA表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05);染毒后28 d,0.448 mg·L-1組CYP3AmRNA表達(dá)量顯著低于對照組(P<0.05)(圖1-B)。染毒后21 d,0.448 mg·L-1組CYP4TmRNA表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05)(圖1-C)。此結(jié)果提示,染毒后的前21 d,馬度米星銨可誘導(dǎo)CYP1A、CYP3A和CYP4TmRNA的表達(dá),但這種誘導(dǎo)作用并無濃度-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。

2.2 馬度米星銨對鯽魚肝CYP450酶系生化指標(biāo)的影響

馬度米星銨對各組EROD活性影響的結(jié)果顯示(圖2-A):染毒后7 d,0.112 mg·L-1和0.224 mg·L-1馬度米星銨組EROD活性低于對照組,0.448 mg·L-1馬度米星銨組活性高于對照組,但均無顯著差異(P>0.05);染毒后14、21和28 d,各染毒組活性均低于對照組,其中14和21 d,0.224和0.448 mg·L-1組EROD活性顯著低于對照組(P<0.05),而其他染毒組與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。表明,馬度米星銨可抑制EROD的活性,這種抑制作用在21 d后趨于平緩。

圖2-B顯示:試驗(yàn)期間,馬度米星銨處理組ERND活性均低于對照組;除7 d 0.112 mg·L-1組、21 d 0.224和0.448 mg·L-1組的ERND活性與對照組相比無顯著差異外(P>0.05),其他染毒組均顯著低于對照組(P<0.05);ERND活性隨染毒時(shí)間的延長呈下降趨勢。表明,馬度米星銨對ERND活性的抑制作用有一定的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。

圖2-C顯示:染毒后14 d,0.224和0.448 mg·L-1組APND活性顯著低于對照組(P<0.05);后期APND活性逐漸上升并恢復(fù)至對照組水平。表明,馬度米星銨對APND的活性先抑制后誘導(dǎo)。

圖2-D顯示:試驗(yàn)期間,馬度米星銨處理組的AH活性呈先升高后下降的趨勢;染毒后的前21 d,各劑量馬度米星銨組AH活性逐漸上升并于21 d達(dá)到最高,其中0.112 mg·L-1組活性顯著高于對照組(P<0.05),同時(shí)AH活性與藥物濃度呈負(fù)相關(guān);AH活性在28 d下降且均低于對照組,其中0.112 mg·L-1組活性顯著低于對照組(P<0.05)。表明,馬度米星銨對AH的活性先誘導(dǎo)后抑制,且AH活性和馬度米星銨之間在前21 d存在濃度-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。

圖2-E顯示:馬度米星銨組NCCR活性呈先降低后升高的趨勢;染毒后14 d,各劑量馬度米星銨組的NCCR活性達(dá)到最低且均低于對照組,其中0.224和0.448 mg·L-1組活性均顯著低于對照組(P<0.05);后期各劑量組NCCR活性逐漸上升并高于對照組,其中0.448 mg·L-1組活性在28 d顯著高于對照組(P<0.05)。表明,馬度米星銨對NCCR的活性先抑制后誘導(dǎo)。

圖2-F顯示:染毒后14 d,0.448 mg·L-1馬度米星銨組CYP450含量顯著低于對照組(P<0.05);在其他時(shí)間點(diǎn),馬度米星銨組的CYP450含量呈波動趨勢,與對照組相比差異均不顯著(P>0.05)。表明,高劑量的馬度米星銨在一定時(shí)間內(nèi)會干擾CYP450的合成。

2.3 對乙酰氨基酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在空白肝微粒體溫孵液中加入不同濃度的對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液,使其終濃度分別為66.5、33.3、16.6、8.3、4.2、2.1、1.0和0.5 μmol·L-1,按照1.3.6節(jié)處理后進(jìn)樣測定,以對乙酰氨基酚和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值對濃度繪圖,得到回歸方程為Y=43.588X-0.093 3(R2=0.999 9)。表明,對乙酰氨基酚在0.5～66.5 μmol·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 體外肝微粒體孵育條件的優(yōu)化

由圖3-A可知:肝微粒體蛋白質(zhì)量濃度為0.2～2.0 mg·mL-1時(shí),對乙酰氨基酚生成率呈線性增長,回歸方程為Y=9.488X+0.535 6(R2=0.996 2),線性范圍內(nèi)比值最高點(diǎn)為0.8 mg·mL-1;由圖3-B可知:孵育時(shí)間為20～90 min時(shí),對乙酰氨基酚生成率呈線性增長,回歸方程為Y=0.108 3X+8.541 8(R2=0.945 4),線性范圍內(nèi)比值最高點(diǎn)為20 min;由圖3-C可知:孵育溫度為4～20 ℃時(shí),對乙酰氨基酚的生成率呈線性增長,回歸方程為Y=0.683 8X-3.097 6(R2=0.924 6),線性范圍內(nèi)比值最高點(diǎn)為20 ℃。因此,最佳孵育條件為:肝微粒體蛋白質(zhì)量濃度0.8 mg·mL-1、孵育時(shí)間20 min、孵育溫度20 ℃。

2.5 馬度米星銨對鯽魚肝微粒體中CYP1A活性的影響

由圖4可知:馬度米星銨對CYP1A活性的抑制率小于25%。表明,馬度米星銨對鯽魚肝微粒體CYP1A活性無影響。

3 討論

在外來化合物的作用下,CYP450酶的活性可以被誘導(dǎo),也可以被抑制。誘導(dǎo)可能是由誘導(dǎo)劑引起相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄激活或增加。抑制作用可通過多種途徑實(shí)現(xiàn),如抑制蛋白的合成、降低CYP450含量、影響藥物氧化過程中電子傳遞及輔酶的合成等。此外,與酶作用底物結(jié)構(gòu)相似的化合物及抑制性抗體的競爭作用,或缺氧也可抑制CYP450酶的活性[16]。

3.1 馬度米星銨對鯽魚肝CYP450酶系相關(guān)基因表達(dá)量的影響

CYP1A是魚類中研究最多的一個(gè)亞族,在致癌效應(yīng)的代謝和激活過程中起著重要作用。CYP1A可被百草枯、多氯聯(lián)苯及多環(huán)芳烴(PAHs)等外源污染物誘導(dǎo)表達(dá),可作為持久性有機(jī)污染物的檢測指標(biāo)[17-19]。在魚體內(nèi),CYP3A是大部分親脂性或弱中性有機(jī)化合物的主要代謝酶[20]。Zhang等[21]試驗(yàn)表明,CYP3A可作為監(jiān)測PAHs和重金屬污染的候選生物標(biāo)志物。CYP4T亞家族只在魚類和兩棲類表達(dá),該亞族在魚體內(nèi)代謝環(huán)境污染物的功能目前還不明確[22]。Liu等[23]研究表明,稀有鮈鯽暴露于全氟辛酸后,鰓中CYP4T11表達(dá)量的增加可能是由過氧化物酶增殖物激活受體(PPAR)介導(dǎo)的。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,馬度米星銨可誘導(dǎo)CYP1A、CYP3A和CYP4TmRNA的表達(dá),但受時(shí)間和劑量的限制,說明CYP1A、CYP3A和CYP4T不適合作為檢測馬度米星銨污染水體的指標(biāo)。另外,馬度米星銨對CYP4T的誘導(dǎo)作用是否由PPAR途徑介導(dǎo)有待進(jìn)一步研究。

3.2 馬度米星銨對鯽魚肝CYP450酶系生化指標(biāo)的影響

EROD是CYP1A活性的標(biāo)志酶。EROD是評估魚類受PAHs影響的生物標(biāo)志物[24]。Pannetier等[25]研究表明青鳉EROD活性的升高可作為苯并芘污染環(huán)境的生物指示物。He等[26]研究表明苯并三唑及其相關(guān)衍生物可抑制海洋扇貝的EROD活性。ERND是CYP3A活性的標(biāo)志酶,對藥物進(jìn)行氧化還原或者水解。Wang等[27]研究表明壬基酚可抑制中華圓田螺ERND的活性。朱雨田[28]研究表明辛硫磷對鯽魚的ERND活性有抑制作用,可用于監(jiān)控有機(jī)磷農(nóng)藥的污染,這與本文結(jié)果相似。ERND對馬度米星銨較為敏感且有一定的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系,適合作為檢測馬度米星銨污染水體的生物標(biāo)志物。EROD和ERND的活性在染毒14 d后均被抑制,推測EROD和ERND在馬度米星銨代謝過程中的解毒作用機(jī)制可能相似。馬度米星銨對ERND的抑制作用強(qiáng)于EROD,說明不同CYP450酶的底物與藥物結(jié)合可能存在競爭機(jī)制,也可能是由于酶的結(jié)構(gòu)存在差異性[29]。此外,馬度米星銨誘導(dǎo)CYP3A的表達(dá),卻抑制其標(biāo)志酶的活性,這種抑制作用可能不通過轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控,為今后進(jìn)一步研究馬度米星銨的毒性機(jī)制提供了依據(jù)。

APND和AH分別是CYP2B和CYP2E1活性的標(biāo)志酶。本試驗(yàn)結(jié)果表明,馬度米星銨處理后的前 14 d APND的活性受抑制,之后活性升高并恢復(fù)至對照組水平。這可能是機(jī)體受到外來物刺激后所表現(xiàn)出的一種自我保護(hù),以緩解抑制效應(yīng)對生物體機(jī)能產(chǎn)生的影響[30]。CYP2E1占肝內(nèi)CYP450總量的 6.6%,是魚體內(nèi)許多低分子有機(jī)化合物及藥物的主要代謝酶,經(jīng)CYP2E1代謝的小分子化合物極易通過各種途徑污染水域[31]。研究表明,硬骨魚類具有CYP2E1樣的蛋白,能被乙醇誘導(dǎo)且呈劑量依賴效應(yīng)[32],這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。我們推測前期機(jī)體大量合成的AH會加速馬度米星銨的代謝,但合成能力有限(ATP供應(yīng)不足、氨基酸數(shù)量不夠等)[33],導(dǎo)致酶活性先升高后降低。

NCCR并不直接參與鯽魚對馬度米星銨的代謝,主要是給CYP450酶系提供電子。本試驗(yàn)結(jié)果表明,馬度米星銨對鯽魚NCCR活性有先抑制后誘導(dǎo)的作用,可能是前期馬度米星銨對鯽魚的毒性作用導(dǎo)致NCCR活性下降,后期機(jī)體蓄積的馬度米星銨中間代謝產(chǎn)物對NCCR活性有誘導(dǎo)作用。

CYP450含量作為常用的診斷指標(biāo)之一,是對P450蛋白總水平的量度。Fu等[34]研究表明,鯉魚CYP450含量可以被阿特拉津誘導(dǎo),但毒死蜱對CYP450含量沒有影響。王國永[35]研究表明馬度米星銨對雞肝臟CYP450含量無顯著影響。這些與本試驗(yàn)結(jié)果不同,可能是由試驗(yàn)藥物、試驗(yàn)物種、染毒方式及染毒時(shí)間不同引起的。

3.3 馬度米星銨對鯽魚肝微粒體CYP1A活性的影響

體外肝微粒體孵育法是在模擬生理環(huán)境條件下進(jìn)行生物代謝研究,易于操作,速度快,重現(xiàn)性好,是研究酶活性最簡單有效的方法。本試驗(yàn)以CYP1A的特異性底物非那西丁作為探針,通過測定其主要代謝產(chǎn)物對乙酰氨基酚的含量來評價(jià)馬度米星銨對CYP1A活性的抑制程度。本試驗(yàn)結(jié)果表明,馬度米星銨對鯽魚肝微粒體CYP1A活性無影響,這與體內(nèi)結(jié)果不同,可能是體內(nèi)外活性有差異或存在其他作用途徑影響EROD活性。

綜上所述,馬度米星銨對鯽魚肝微粒體CYP1A活性無影響;馬度米星銨對ERND活性的抑制作用可能與CYP3A的轉(zhuǎn)錄水平無關(guān);ERND對馬度米星銨較為敏感,適合作為馬度米星銨污染水體的生物標(biāo)志物,為水環(huán)境的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估提供科學(xué)依據(jù)。