HPLC法測定生大黃、清蒸大黃的大承氣湯活性成分分析

秦素紅 覃俏峰

摘要：使用HPLC法同時測定生大黃、清蒸大黃的大承氣湯中10個活性成分含量，色譜柱為Agilent Zorbax SB- C18（5 μm×4.6 mm×250 mm），流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫，流速為1 mL/min，檢測波長280、254 nm，柱溫30 ℃。結(jié)果表明，生大黃和清蒸大黃的大承氣湯中10個活性成分的標準曲線在檢測范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系;方法學考察達到試驗要求。生大黃和清蒸大黃的大承氣湯中的10個活性成分含量均有不同程度的變化，這些變化與生大黃、清蒸大黃配伍的大承氣湯作用相對應(yīng)，且大黃蒽醌類成分含量的變化在一定程度上對大承氣湯的功效存在著一定的影響和共性關(guān)系。

關(guān)鍵詞：大黃;大承氣湯;活性成分;HPLC

中圖分類號：O657.7+2;S567.1+9 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）15-0129-07

Abstract： Simultaneous determination of 10 active ingredients in Dachengqi decoction of rhubarb and steamed rhubarb by HPLC. The column was Agilent Zorbax SB-C18（5 μm×4.6 mm×250 mm）， the mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid aqueous solution， gradient elution， flow rate was 1 mL/min， detection wavelength was 280 nm and 254 nm， column temperature was 30 ℃. The results showed that the 10 standard curves of 10 active ingredients in Dachengqi decoction of rhubarb and steamed rhubarb showed a good linear relationship in the detection range; the methodological investigation reached the test requirements. The content of 10 active ingredients in Dachengqi decoction of rhubarb and steamed rhubarb varied to varying degrees. The content of 10 active ingredients in rhubarb and steamed rhubarb has different degrees of change. These changes correspond to the effect of Dachengqi decoction in combination with raw rhubarb and steamed rhubarb， and the content of rhubarb anthraquinones to a certain extent， there is a certain influence and common relationship on the efficacy of Dachengqitang.

Key words： rhubarb; Dachengqi decoction; active ingredients; HPLC

大承氣湯出自漢代張仲景的《傷寒論》，由大黃、枳實、厚樸和芒硝組成，是瀉法的代表方劑[1-3]，具有峻下熱結(jié)的藥效，主治陽明腑實證、熱結(jié)旁流和里熱實證等[4-6]。中藥大黃的主要活性成分是蒽醌類化合物，以游離型與結(jié)合型2種形式存在[7，8]。大黃蒽醌類成分是中藥大黃的瀉下活性成分之一，厚樸中的厚樸酚類具有抗病原微生物和調(diào)節(jié)胃腸運動等作用[9]，枳實中的黃酮類具有抗炎和利尿等藥理作用[10]。以上活性成分是大承氣湯藥理作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，也是質(zhì)量控制常用的指標物[11]。本試驗擬采用HPLC法測定生大黃和清蒸大黃的大承氣湯中10個活性成分含量變化差異，系統(tǒng)地研究生大黃和清蒸大黃對大承氣湯活性成分的變化。

1 材料與方法

1.1 儀器

2695型高效液相色譜儀，美國Waters公司; D1810C型電子分析天平，上海申生科技有限公司;TGL-16G高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.2 試劑

蘆薈大黃素（批號：160520，純度>98%）、大黃素（批號：170224，純度>98%）、大黃素甲醚（批號：160602，純度>98%）、大黃酚（批號：20160124，純度>98%）、大黃酸（批號：170219，純度>98%）、柚皮苷（批號：161223，純度>98%）、橙皮苷（批號：170213，純度>98%）、新橙皮苷（批號：161226，純度>98%）、厚樸酚（批號：161107，純度>98%）、和厚樸酚（批號：161129，純度>98%）均購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司;色譜甲醇和色譜乙腈均為美國Fisher公司提供，甲醇、乙醇和磷酸為分析純，試驗用水為超純水。

1.3 藥材

中藥飲片大黃（產(chǎn)地四川，批號 160307001）、枳實（產(chǎn)地江西，批號160101771）、姜厚樸（產(chǎn)地陜西，批號160507021）和芒硝（產(chǎn)地青海，批號160307611）。生大黃、枳實、厚樸及芒硝購于廣東康美藥業(yè)有限公司，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學藥用植物教研室李斌副教授鑒定，中藥大黃為蓼科植物藥用大黃（Rheum officinale Baill.）的干燥根和根莖，枳實為蕓香科植物酸橙（Citrus aurantium L.）的干燥幼果，厚樸為木蘭科植物厚樸（Magnolia officinalis Rehd. et Wils.）或凹葉厚樸（Magnolia officinalis Rehd. et Wils. var. biloba Rehd.et Wils.）的干燥干皮、根皮及枝皮，以上三味中藥粉碎過10目篩。芒硝，中藥名，經(jīng)鑒定為硫酸鹽類礦物芒硝族芒硝，為結(jié)晶體，主要含十水硫酸鈉（Na2SO4·10H2O）。所用炮制品均使用上述生大黃按照《全國中藥飲片炮制規(guī)范》和2015年版《中國藥典》的炮制方法炮制（表1）。

1.4 方法

1.4.1 大承氣湯提取液制備 按處方比例分別精密稱取厚樸藥材粉末、枳實、大黃、芒硝2.4、1.2、1.2、0.9 g，厚樸與枳實加超純水50 mL浸泡30 min，加熱煮沸后保持微沸30 min，500目濾布濾過，藥渣再加超純水50 mL浸泡30 min后，加熱煮沸后保持微沸30 min，濾過，合并兩次濾液并加入大黃粉末（生大黃、清蒸大黃）浸泡20 min，加熱煮沸后保持微沸20 min，用500目濾布濾過，藥渣再加超純水30 mL，加熱煮沸后保持微沸20 min，濾過，合并濾液，趁熱加入芒硝，攪拌使其溶解，將濾液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加超純水稀釋至刻度，搖勻，得大承氣湯全方水提液，標記為DCQT。由于研究的是2種大黃炮制品的大承氣湯，每種炮制品的大承氣湯制備6份，分別編號為生DCQT 1-6，清蒸DCQT 1-6。

1.4.2 供試品溶液的制備 精確量取“1.4.1”提取液各5 mL，分別置于20 mL容量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，取適量稀釋液13 000 r/min離心10 min，取上清液適量，22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得大承氣湯供試品溶液[12]。

1.4.3 對照品儲備液的制備 分別取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蘆薈大黃素、大黃酸、和厚樸酚、厚樸酚、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚10.80、10.70、12.50、10.50、11.20、11.00、10.80、 11.50、11.00、10.80 mg，置于10個10 mL容量瓶中，加甲醇使之溶解定容至刻度，搖勻，即得各對照品儲備液。

1.4.4 混合對照品溶液的制備 分別精密吸取“1.4.3”下各對照品儲備液適量，置于同一個10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混合均勻，即得混合對照品溶液。

1.5 色譜條件

色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18（5 μm×4.6 mm×250 mm），流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫程序見表2，流速1 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量10 μL，設(shè)定柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷檢測波長為280 nm，蘆薈大黃素、大黃酸、和厚樸酚、厚樸酚、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚檢測波長為254 nm。理論塔板數(shù)以橙皮苷峰計算應(yīng)不低于3 000，以柚皮苷峰計算不低于4 000，以大黃素計算應(yīng)不低于3 000。大承氣湯中的10個活性成分都能較好地分離，樣品中其他成分對測定成分無干擾（圖1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 檢測波長的選擇 根據(jù)查閱的相關(guān)文獻[9]以及預(yù)試驗，柚皮苷、橙皮苷及新橙皮苷在280 nm處有最大的紫外吸收，色譜峰形良好;大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃酸、和厚樸酚、厚樸酚和大黃素甲醚在254 nm ?處有較強的紫外吸收。故本試驗最終采用280和254 nm兩個檢測波長。

2.1.2 標準曲線的制作 分別精密吸取上述一定量的對照品溶液，置棕色容量瓶中混合，甲醇定容至刻度，配制成7個不同濃度的大承氣湯混合對照品溶液，進樣量為10 μL，分別進樣，液相色譜儀檢測，測定峰面積，以濃度（μg/mL）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，并計算回歸方程，回歸方程見表3。將混合對照品溶液逐步稀釋，得一系列混合對照品溶液，分別進樣，測定其信號（以峰高計）與噪聲比值，將S/N=3時的濃度定為檢測限（LOD），將S/N=10時的濃度定為定量限（LOQ），各組分在各自含量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（表3）。

2.1.3 精密度試驗 取同一生DCQT供試品溶液，連續(xù)進樣6次，測定各活性成分的峰面積，測得生DCQT中的柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蘆薈大黃素、大黃酸、和厚樸酚、厚樸酚、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積的RSD分別為1.59%、2.69%、2.07%、2.44%、2.51%、2.34%、2.48%、2.43%、2.93%和2.50%，RSD均小于3.00%，說明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一生DCQT和清蒸DCQT供試品溶液，分別于供試品溶液制備后0、2、4、8、12、24 h進樣測定各DCQT供試品中10種成分的峰面積。結(jié)果表明，生DCQT供試品中的柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蘆薈大黃素、大黃酸、和厚樸酚、厚樸酚、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積的RSD值分別為1.78%、2.62%、1.88%、2.98%、1.95%、2.36%、1.95%、2.65%、2.11%、1.88%;清蒸DCQT供試品中的柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蘆薈大黃素、大黃酸、和厚樸酚、厚樸酚、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積的RSD值分別為2.51%、2.90%、1.89%、2.21%、2.57%、2.97%、2.36%、1.94%、2.55%、2.34%，其RSD均小于3.0%，表明供試品溶液在 ? 24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性試驗 精密量取生DCQT、清蒸DCQT樣品各6份，分別測定各供試品的峰面積，計算各DCQT提取液中的柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蘆薈大黃素、大黃酸、和厚樸酚、厚樸酚、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的平均質(zhì)量濃度和RSD，試驗結(jié)果見表4、表5。由表4、表5可知，試驗重復(fù)性良好。

2.1.6 加樣回收率試驗 減半精密量取生DCQT、清蒸DCQT樣品各6份，分別加入對照品溶液適量（柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蘆薈大黃素、大黃酸、和厚樸酚、厚樸酚、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚分別為1.08、1.07、1.25、1.05、1.12、1.10、1.08、1.15、1.10、1.08 mg/mL），按照供試品溶液的制備方法制備，續(xù)濾液以13 000 r/min離心10 min，取上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，計算各DCQT提取液中的柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蘆薈大黃素、大黃酸、和厚樸酚、厚樸酚、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的平均回收率和對應(yīng)的RSD（表6、表7）。由表6、表7可知，該方法準確性良好。

2.2 樣品含量測定

分別精密量取生DCQT 1-6、清蒸DCQT 1-6大承氣湯提取液各5 mL，加無水乙醇定容至20 mL，搖勻，濾過，離心，0.45 μm微孔濾膜過濾進行檢測分析（表8）。

3 討論

中藥方劑成分復(fù)雜，常用的檢查儀器與分析方法難以進行分離和檢測。本試驗選用HPLC法同時測定并比較2種大黃炮制品的大承氣湯中10種活性成分的含量差異，該方法簡便，靈敏度高，重復(fù)性好，便于推廣應(yīng)用。通過結(jié)合相關(guān)文獻[13]和預(yù)試驗，對不同流動相、柱溫、流速等因素進行考察，選擇基線較平穩(wěn)、分離度較好的色譜條件。本試驗檢測波長的選擇是綜合考慮大承氣湯中10個主要活性成分的紫外吸收光譜，使被測活性成分都有較好的紫外吸收，通過比較后發(fā)現(xiàn)，柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷在280 nm有較大的紫外吸收，而蘆薈大黃素、大黃酸、和厚樸酚、厚樸酚、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚在254 nm有較好的紫外吸收，因此選擇雙波長切換法測定大承氣湯中10種活性成分含量，該試驗方法簡單快速靈敏度高，對大承氣湯的質(zhì)量控制有一定的參考價值，值得應(yīng)用于其他中藥方劑的質(zhì)量控制。

試驗比較了甲醇-水、甲醇-0.1%冰醋酸、甲醇-0.3%冰醋酸、甲醇-0.2%磷酸、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.05%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸和乙腈-0.2%磷酸等洗脫系統(tǒng)對出峰時間、分離度和基線的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用乙腈-0.1%磷酸系統(tǒng)對色譜峰分離度較好，基線較平穩(wěn)，適當?shù)恼{(diào)整梯度洗脫程序，都能使各峰達到良好的分離，且基線較平衡，因此本試驗釆用乙腈-0.1%磷酸系統(tǒng)進行梯度洗脫。

本試驗考察20、25、30和35 ℃柱溫對分離度、出峰時間以及基線是否平穩(wěn)的影響，試驗結(jié)果表明，柱溫對其影響較小，因此本試驗柱溫采用30 ℃;試驗還考察了3種不同流速1.2、1.0、0.8 mL/min對分離度的影響，色譜圖顯示1.0 mL/min時分離度較好，基線也較平衡，故本試驗采用的流速為1.0 mL/min。

由于中藥復(fù)方組分的復(fù)雜性，活性成分含量低，給活性成分的檢測帶來了很大困難。中藥復(fù)方在制備過程中由于溶媒和加熱的影響，可能發(fā)生物理和化學變化，此復(fù)雜體系又是一個動態(tài)變化的，使藥材中的化學成分發(fā)生各種動態(tài)變化，甚至產(chǎn)生新的成分（主要包括配位絡(luò)合物、分子絡(luò)合物等）以及藥液pH變化、氧化還原反應(yīng)等導致不溶性復(fù)合物的生成[14]。

使用HPLC法測定生大黃和清蒸大黃的大承氣湯中的10種活性成分試驗結(jié)果表明，總黃酮的含量變化沒有顯著性差異;厚樸酚類成分也沒有顯著性差異;而5個蒽醌類成分的總量有顯著性差異，即生大黃的大承氣湯中蒽醌類成分含量較多。

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