水蛭提取液對人視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞的抑制作用

李園媛，鄭燕林，劉曉莉，李 暉，王 芳，鄭 淼，張馨月，馬宏杰

0引言

視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma，RB)是一種起源于原始視網(wǎng)膜層的人類惡性腫瘤，是主要發(fā)生于兒童的常見眼內(nèi)惡性腫瘤[1-2]。據(jù)估計，全世界每年約有8000名兒童發(fā)生RB，占所有兒童癌癥的3%，與RB相關的死亡約占所有嬰兒死亡的1%[3]。在RB治療中，最常用的治療方案是化療聯(lián)合免疫治療[4]，但這種治療易產(chǎn)生各種副作用，包括對RB細胞產(chǎn)生的細胞毒性、RB進程的加速、腫瘤對化療藥物的耐藥性等[5-6]。此外，RB多發(fā)生于兒童，患者的身體功能較弱、長期化療對兒童健康的影響不容忽視。這意味著開發(fā)其他毒副作用小的藥物，或輔助化療、降低化療藥物副作用的藥物非常必要[7-8]。

中藥作為天然藥物，具有不良反應少、遺傳毒性低等優(yōu)點，可以在治療癌癥的同時對機體功能從根本上進行調(diào)理[9]。隨著中藥藥理研究的進一步深入，臨床應用日益廣泛，無論是中藥單體有效成分，還是中藥復方，中醫(yī)中藥在防治腫瘤疾病方面均已取得重要進展，基礎實驗及臨床研究均揭示了中醫(yī)中藥在治療腫瘤病變方面的顯著優(yōu)勢。目前，常用的抗腫瘤藥物有通關藤、鴉膽子、人參、麥冬、黃芪、苦參、薏苡仁、水蛭等[10]。

視網(wǎng)膜母細胞瘤歸屬于中醫(yī)“癥瘕積聚”的范疇，主要治療手段有清熱解毒、活血化瘀、扶正培本、益氣養(yǎng)陰、軟堅散結(jié)、以毒攻毒等。水蛭能破血逐瘀，通經(jīng)消癥，主要治療血瘀經(jīng)閉癥 、瘕痞塊及跌打損傷病，臨床上水蛭被用于治療食管癌、胃癌、腸癌、子宮癌、乳腺癌等腫瘤具有較好的療效[11]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，水蛭具有抑制成纖維細胞增生的作用[12]，故推測水蛭對RB細胞可能也具有抑制作用。因此，本研究旨在評估水蛭提取液對人視網(wǎng)膜母細胞瘤WERI-RB-1細胞系的活性、周期、凋亡、侵襲等方面的影響，為水蛭抗腫瘤的臨床應用提供前期基礎數(shù)據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗細胞人視網(wǎng)膜母細胞瘤WERI-RB-1細胞系，來源于中國科學院上海生命科學研究院，編號：3131C0001001200012。

1.1.2主要試劑水蛭干粉(蘭州安泰堂中藥飲片公司，原產(chǎn)地：中國安徽，生產(chǎn)批號：14082702，GMP證書號：甘J0071)，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，Clark)，RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco)，CCK-8試劑盒(Glpbio)，雙抗(Hyclone)，Annexin V-APC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(BestBio)，Matrigel基底膠(Solarbio)，MTT(Biofroxx)，碘化丙啶(propidium iodide，PI，Amresco)，RNaseA(Sigma)，4%多聚甲醛 (Biosharp)。

1.1.3主要儀器設備細胞培養(yǎng)箱(三洋電機國際貿(mào)易有限公司)，流式細胞儀(BD公司)，倒置生物顯微鏡(Olympus公司)。

1.2方法

1.2.1水蛭提取液的配制水蛭提取液采用水提法配制。20g水蛭干粉溶于40mL PBS，以此比例混合，根據(jù)《中華藥典》中使用凝血酶測定水蛭提取液中水蛭素的濃度，經(jīng)過多次反復提取及測定，水蛭提取液中水蛭素濃度穩(wěn)定在0.04U/mL。

1.2.2 CCK-8試劑盒檢測藥物對細胞活性的影響(1)細胞鋪板：取對數(shù)生長期的WERI-RB-1細胞，調(diào)節(jié)細胞密度為2×105cells/mL。接種于96孔細胞板中，每孔加入100μL細胞懸液，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。(2)藥物濃度稀釋：將上述配制的水蛭提取液用完全培養(yǎng)基稀釋至終濃度0(對照組)、0.02、0.04、0.08、0.16U/mL。(3)藥物處理細胞：將96孔細胞板中每孔中舊培養(yǎng)基吸去，添加100μL含相應藥物濃度的培養(yǎng)基。每個藥物濃度設6個復孔。以不含藥物、僅在培養(yǎng)基中生長的細胞作為對照組A；以不含藥物和細胞、僅有培養(yǎng)基作為對照組B。分別于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0、24、48、72h。(4)CCK-8試劑處理：根據(jù)CCK-8試劑盒說明書，按CCK-8試劑∶培養(yǎng)基=1∶10的比例配制工作液。每孔加100μL CCK-8工作液，震蕩細胞培養(yǎng)板混勻后，細胞培養(yǎng)箱孵育0.5～4h。(5)檢測：從添加CCK-8試劑開始計時，每30min進行1次酶標儀檢測，測定450nm處的吸光度(OD)值。取組間差異顯著的檢測時間點數(shù)據(jù)進行分析。計算藥物對細胞增殖的抑制率，細胞增殖抑制率=(OD對照組A-OD實驗組)/(OD對照組A-OD對照組B)×100%。

1.2.3流式細胞技術(shù)檢測藥物對細胞周期分布的影響將WERI-RB-1細胞(5×105cells/mL)接種于6孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。待細胞生長狀態(tài)良好后，離心更換終濃度為0.04、0.08U/mL的水蛭提取液含藥培養(yǎng)基處理48h(實驗組藥物作用濃度和時間根據(jù)CCK-8檢測結(jié)果確定)，對照組加入不含水蛭提取液的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h。離心棄去培養(yǎng)基后使用預冷的PBS清洗2遍，分別收集各組細胞，預冷的70%乙醇固定細胞后-20℃冰箱保存固定48h，離心，收集細胞沉淀，加入終濃度為1mg/mL RNaseA和50μg/mL PI染色液后進行流式細胞儀檢測，分析細胞周期的分布。每組設6個重復。

1.2.4流式細胞技術(shù)檢測藥物對細胞凋亡的影響取對數(shù)生長期的WERI-RB-1細胞，調(diào)節(jié)細胞密度5×105cells/mL，2mL/孔接種于6孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細胞生長狀態(tài)良好后，離心更換終濃度為0.04、0.08U/mL的水蛭提取液含藥培養(yǎng)基處理48h(實驗組藥物作用濃度和時間根據(jù)CCK-8檢測結(jié)果確定)，對照組加入不含水蛭提取液的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h。將細胞液移入1.5mL管中，1000r/min離心5min，吸除上清液，PBS洗滌1次，吸除上清液，用500μL 4%多聚甲醛固定30min，PBS洗滌1次，吸除上清液，用500μL Binding Buffer重懸細胞后，加入5μL Annexin V-APC輕輕吹勻，再加入5μL PI混勻，室溫避光反應15min，上機檢測分析。每組設6個重復。

1.2.5 Transwell侵襲實驗檢測藥物對細胞侵襲能力的影響從-20℃冰箱中取出Matrigel基質(zhì)膠，將其置于4℃冰箱過夜融化。Matrigel與無血清培養(yǎng)基以1∶8的比例稀釋，吸取80μL加入Transwell的上室中，放置于培養(yǎng)箱中孵育2h。取對數(shù)生長期的細胞，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，收集細胞，1000r/min離心5min，吸除上清液，調(diào)節(jié)細胞密度為1×106cells/mL，200μL/孔接種于Transwell小室中，分為對照組(培養(yǎng)基+細胞)，0.04U/mL實驗組(0.04U/mL的水蛭提取液含藥培養(yǎng)基+細胞)和0.08U/mL實驗組(0.08U/mL的水蛭提取液含藥培養(yǎng)基+細胞)，Transwell下室加入600μL含10%血清的培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)48h。PBS洗滌，100%乙醇固定30min，PBS洗滌2次，0.1%結(jié)晶紫染色15min，PBS洗去多余結(jié)晶紫，于顯微鏡下對下室細胞進行拍照。因穿過細胞過多無法通過計數(shù)獲得準確的細胞數(shù)故本研究采用間接計數(shù)法，于24孔板中加入500μL含0.5mg/mL MTT的完全培養(yǎng)基，將下室置于其中，37℃孵育4h后取出，于孔板中加入500μL DMSO，振蕩10min，取出下室，將24孔板中的液體吸至96孔板中于酶標儀570nm處檢測OD值。每組重復6次。

表1 水蛭提取液對細胞增殖抑制率的影響

圖1 水蛭提取液對WERI-RB-1細胞活性的影響 F0h=2.3，P0h>0.05；F24h=37.7，P24h<0.05；F48h=124.1，P48h<0.01；F72h=98.6，P72h<0.01 。aP<0.05， bP<0.01 vs 同時間0U/mL。

2結(jié)果

2.1不同濃度水蛭提取液對細胞活性的影響CCK-8法檢測水蛭提取液對WERI-RB-1細胞活性(圖1)和增殖抑制率(表1)結(jié)果顯示，作用24、48、72h時，0.02U/mL水蛭提取液組細胞活性與對照組均無明顯差異(P>0.05)，且細胞增殖抑制率均為負數(shù)，表明0.02U/mL水蛭提取液可在一定程度上促進細胞增殖；作用24h時，0.04、0.08U/mL水蛭提取液組細胞活性與對照組均無明顯差異(P>0.05)，對細胞增殖具有一定的抑制作用，但細胞抑制率較小；作用48、72h時，0.04、0.08U/mL水蛭提取液組細胞活性均較對照組明顯降低(P<0.05)，且均可抑制細胞增殖；作用24、48、72h時，0.16U/mL水蛭提取液組細胞活性均較對照組明顯降低(P<0.01)，細胞增殖抑制率分別為(15.9±3.26)%、(30.4±4.61)%、(44.9±2.53)%，表明0.16U/mL水蛭提取液作用48、72h時可產(chǎn)生明顯的細胞毒性，故本研究選擇0.04、0.08U/mL水蛭提取液作用48h為最佳干預條件進行后續(xù)實驗。

2.2水蛭提取液對細胞周期的影響流式細胞技術(shù)檢測結(jié)果顯示，0.04、0.08U/mL水蛭提取液處理WERI-RB-1細胞48h，細胞周期主要阻滯在G2/M期(圖2A)，對照組、0.04U/mL實驗組、0.08U/mL實驗組G2/M期陽性細胞率分別為(3.00±2.32)%、(12.59±5.36)%、(14.79±4.12)%，差異有統(tǒng)計學意義(F=476.3，P<0.001)，且實驗組G2/M期陽性細胞率均明顯高于對照組(P<0.01，表2，圖2B)。

2.3水蛭提取液對細胞凋亡的影響流式細胞技術(shù)檢測結(jié)果顯示，0.04、0.08U/mL水蛭提取液處理WERI-RB-1細胞48h，細胞凋亡率明顯升高(圖3)。對照組、0.04U/mL實驗組、0.08U/mL實驗組細胞凋亡率分別為(4.64±2.56)%、(37.91±3.44)%、(33.05±2.25)%，差異有統(tǒng)計學意義(F=792.6，P<0.001)，且實驗組細胞凋亡率均明顯高于對照組(P<0.01，表3)。

2.4水蛭提取液對細胞侵襲能力的影響Transwell侵襲實驗檢測結(jié)果顯示，0.04、0.08U/mL水蛭提取液處理WERI-RB-1細胞48h，實驗組Transwell小室下細胞數(shù)明顯少于對照組，表明實驗組細胞侵襲被抑制(圖4)。MTT法統(tǒng)計Transwell下室細胞數(shù)結(jié)果顯示，對照組、0.04U/mL實驗組、0.08U/mL實驗組OD值分別為1.21±4.36、0.44±2.08、0.53±3.42，差異有統(tǒng)計學意義(F=2537.4，P<0.001)，且實驗組OD值均明顯低于對照組(P<0.01)。

3討論

水蛭(hirude nipponica whitman)作為一種傳統(tǒng)的活血化瘀類中藥，其用于治療腫瘤有較悠久的歷史。蟲類藥性喜攻逐走竄，通經(jīng)達絡，搜剔疏利，無處不至，以治療諸多疑難雜癥、沉疴痼疾而著稱[11]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明水蛭主要通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、抗血小板聚集和抗凝血作用、提高機體免疫力、抗腫瘤多藥耐藥性(multidrug resistance MDR)的途徑發(fā)揮其抗腫瘤作用[12-13]。這為水蛭抗腫瘤的臨床應用提供了理論依據(jù)，也為臨床治療腫瘤提供了新的思路[14]。但是由于水蛭有效成分的多樣性和視網(wǎng)膜母細胞瘤發(fā)病機制的復雜性，關于水蛭對視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞的益處的研究目前還沒有。因此，深入研究水蛭素對視網(wǎng)膜母細胞瘤的藥理作用是十分必要的。

圖2 水蛭提取液對WERI-RB-1細胞周期的影響 A：流式細胞儀檢測細胞周期結(jié)果圖(A1:對照組；A2：0.04U/mL 實驗組；A3：0.08U/mL實驗組)；B：各組G0/G1、S、G2/M期陽性細胞率統(tǒng)計圖；aP<0.05，bP<0.01 vs對照組。

圖3 流式細胞儀檢測水蛭提取液對WERI-RB-1細胞凋亡的影響 A:對照組；B：0.04U/mL 實驗組；C：0.08U/mL實驗組。

圖4 Transwell侵襲實驗結(jié)果(Transwell小室下細胞，×200) A：對照組；B：0.04U/mL實驗組；C：0.08U/mL實驗組。

表2 水蛭提取液對細胞周期分布的影響

表3 水蛭提取液對細胞凋亡的影響

具有活性的細胞在正常生理條件下能夠進行有絲分裂，保持一定的細胞增殖狀態(tài)。在受到外界損傷性條件(如藥物、物理刺激)影響時，可以表現(xiàn)為細胞增殖減慢，細胞非正常死亡增多，細胞形態(tài)學發(fā)生變化。本研究中，我們首先采用CCK-8法研究藥物對細胞活性的影響，以此篩選藥物最佳干預濃度和時間點。該實驗方法簡單易行，實驗條件可控性強，最重要的是無需更換培養(yǎng)液，適合WERI-RB-1這樣的懸浮細胞，在研究視網(wǎng)膜母細胞瘤的基礎實驗方面可以提供良好的、穩(wěn)定的實驗結(jié)果。分析實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.04、0.08U/mL水蛭提取液干預48h抑制活細胞數(shù)量效果最佳。

CCK-8檢測結(jié)果已經(jīng)證實水蛭提取液對WERI-RB-1細胞具有抑制增殖作用，活細胞數(shù)量減少是由于細胞周期分布阻滯，還是凋亡數(shù)量增加導致，或是通過其他的作用機制引起仍需深入研究。細胞增殖過程中細胞周期的調(diào)節(jié)進展是腫瘤進展、抗腫瘤治療反應、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的關鍵因素[15-16]。細胞凋亡是一種生理現(xiàn)象，但在腫瘤疾病中，誘導腫瘤細胞凋亡，是抑制腫瘤的關鍵[17]。本研究中，我們采用流式細胞儀檢測藥物對細胞周期和凋亡的影響，結(jié)果顯示，0.04、0.08U/mL水蛭提取液使細胞周期主要阻滯在G2/M(有絲分裂)期，且均可誘導WERI-RB-1細胞凋亡率上調(diào)。陶義豐等[18]研究發(fā)現(xiàn)，水蛭素可明顯抑制鼻咽癌細胞增殖，該作用可能與水蛭素上調(diào)Bax和p21 mRNA表達有關。賀彬等[19]研究發(fā)現(xiàn)水蛭素和阿霉素均對人舌鱗癌細胞株TCA8113具有抑制作用，水蛭素的作用機制可能為誘導細胞凋亡并阻滯細胞周期于G0/G1(合成)期，水蛭素可增強阿霉素的敏感性，有助于阿霉素化療過程的增效減毒作用。本研究發(fā)現(xiàn)，水蛭提取液使WERI-RB-1細胞周期主要阻滯在G2/M期，這與上述研究結(jié)果不同，分析其原因，可能與人視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞自身生物特性有關，或與抑制凝血酶引起周期細胞活性改變有關，也可能與水蛭素與水蛭提取液本身成分不同，影響細胞周期的成分靶點不同有關。在隨后的研究中，我們將進一步研究。

轉(zhuǎn)移是視網(wǎng)膜母細胞瘤最可怕的一面，腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的可能性取決于其與促進腫瘤細胞生長、存活、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移的體內(nèi)平衡因子之間的相互作用[20-21]。本研究采用Transwell侵襲實驗檢測藥物對細胞侵襲能力的影響，結(jié)果表明藥物干預組Transwell下室WERI-RB-1細胞數(shù)目均較對照組顯著下調(diào)。Blankenship等[22]從吸血水蛭ghilianii唾液腺中分離得到一種蛋白Ghilanten，研究發(fā)現(xiàn)其具有抑制黑色素瘤、乳腺癌、肺癌和前列腺癌轉(zhuǎn)移的作用，這與本研究結(jié)果相似。

綜上所述，本研究從細胞生物學角度研究水蛭提取液對人視網(wǎng)膜母細胞瘤WERI-RB-1細胞的影響，結(jié)果證明水蛭提取液可有效抑制細胞增殖和侵襲，并誘導細胞凋亡。水蛭提取液通過對視網(wǎng)膜母細胞瘤WERI-RB-1細胞活性抑制、周期阻滯、誘導凋亡、抑制侵襲發(fā)揮作用，有望成為視網(wǎng)膜母細胞瘤的治療藥物。然而，本研究也存在不足之處，如藥物的劑量效應關系、時間效應關系實驗還不夠詳細，未設立陽性常用藥物對照組等，水蛭提取液抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤的分子機制還需深入研究。