液質(zhì)聯(lián)用測定蜂蜜中鉤吻堿和鉤吻堿子

羅達(dá)龍，王華，陳超杰*，鐘家良，姚泳成

1. 梧州市食品藥品檢驗(yàn)所（梧州 543002）；2. 梧州學(xué)院（梧州 543002）

鉤吻堿類生物堿主要存在于馬錢科植物胡蔓藤（Gelsemium elegans（Gardn. et Champ.）Benth.）中，俗稱斷腸草，民間有用藥史，常用于跌打損傷、骨折、皮膚濕疹等，因其有大毒，主要作為外用，誤服能致命，由于誤食含鉤吻堿和鉤吻堿子的野生蜂蜜而導(dǎo)致中毒的報(bào)道也屢見不鮮，文獻(xiàn)[1]報(bào)道廣西環(huán)江、羅城兩地發(fā)生3起食用含鉤吻堿和鉤吻堿子的野生蜂蜜中毒，共造成13人中毒、3人死亡。2015—2016年，梧州地區(qū)共發(fā)生2起因誤食鉤吻（斷腸草）引起的生物堿中毒事件，造成6人中毒1人死亡。在廣東茂名市公安局早期《鉤吻堿中毒40例尸檢分析》中，記載利用鉤吻投毒致死15人、服鉤吻自殺20人、為治病服藥5人事件[2]，由此可見因誤食鉤吻導(dǎo)致中毒或死亡的案例時(shí)有發(fā)生。建立快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的檢測方案很有必要。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜儀為Agilent LC-1290（購于美國安捷倫公司）；質(zhì)譜儀為Agilent QQQ-6490（購于美國安捷倫公司）；離心機(jī)（轉(zhuǎn)速≥3 000 r/min）；全自動(dòng)平行濃縮儀（AutoEVA-60，?？苾x器有限公司）；超聲波發(fā)生器（Eimasonic P180H）；天平：感量分別為0.01 mg，0.1 mg和0.01 g。

鉤吻堿（鉤吻素甲、貨號(hào)NACC60513、純度≥98%、中國廣州分析測試中心）；鉤吻堿子（鉤吻素子、貨號(hào)NACC60512、純度≥98%、中國廣州分析測試中心）。

甲醇、甲酸、乙腈（色譜純，美國歐姆尼公司）；氨水、鹽酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；MCX固相萃取柱（型號(hào)Creole MCX 60 mg/3 mL，美國歐姆尼公司）；0.22 μm有機(jī)濾膜（美國歐姆尼公司）。試驗(yàn)用水為經(jīng)ELGA PURELAB Classic UVF凈化系統(tǒng)過濾的去離子水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 mg/mL）：精密稱取鉤吻堿、鉤吻堿子標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。-20 ℃避光貯存，有效期6個(gè)月。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液（1 μg/mL）：分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 mg/mL）各0.10 mL，用甲醇稀釋至100 mL，搖勻，制成1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確吸取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液（1 μg/mL），用50%甲醇水（含0.1%甲酸）溶劑稀釋，搖勻，作為系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，各化合物質(zhì)量濃度依次為1，2，8，10和20 ng/mL。

1.2.2 樣品前處理

稱取1 g（精確至0.01 g）制備均勻的樣品置于100 mL一次性離心管中，加入1%鹽酸水溶液至50 mL，渦旋振蕩2 min后超聲處理（100 W，40 kHz）30 min，以3 000 r/min離心5 min，吸取5.00 mL上清液到已活化的MCX柱（依次用甲醇3 mL、水3 mL活化），依次用5 mL水、5 mL甲醇淋洗，棄去全部流出液，抽干MCX柱，用5 mL 5%氨化甲醇洗脫，收集洗脫液，并于40℃氮吹至干，加入溶劑1.00 mL 50%甲醇水（含0.1%甲酸）溶解殘?jiān)^0.22 μm有機(jī)濾膜，備用。

1.2.3 液相色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱：ACE Ultra Core C18（2.5 μm，2.1 mm×75 mm）。流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%甲酸水溶液（含5 mmol/L甲酸銨）。流速0.35 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量0.50 μL；電噴霧源離子源（ESI），正離子方式，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），載氣溫度200℃，載氣流量14 L/min，霧化器壓力25 Psi，鞘氣溫度350 ℃，鞘氣流量12 L/min，毛細(xì)管電壓3 500 V。

表1 梯度洗脫程序

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

用溶劑50%甲醇水（含0.1%甲酸）分別配制鉤吻堿、鉤吻堿子，質(zhì)量濃度分別為1 μg/mL。在儀器調(diào)諧通過后分別對(duì)上述2個(gè)物質(zhì)進(jìn)行全掃描，得到全掃描一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)后進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，對(duì)所得到的子離子的質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行逐個(gè)優(yōu)化，優(yōu)化后化合物質(zhì)譜參數(shù)詳見表2，二級(jí)質(zhì)譜圖見圖1和圖2。

表2 鉤吻堿與鉤吻堿子質(zhì)譜參數(shù)

圖1 鉤吻堿二級(jí)質(zhì)譜圖

圖2 鉤吻堿子二級(jí)質(zhì)譜圖

2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.2.1 提取條件優(yōu)化

試驗(yàn)考察純化水、0.5%鹽酸水溶液、1%鹽酸水溶液、1.5%鹽酸水溶液和2%鹽酸水溶液對(duì)添加鉤吻堿和鉤吻堿子標(biāo)準(zhǔn)溶液的野生蜂蜜進(jìn)行同步提取、稀釋后上機(jī)測定。通過對(duì)比考察所用的溶劑對(duì)鉤吻堿和鉤吻素子的提取效率來確定所用的提取溶劑。由于鉤吻堿和鉤吻堿子均為生物堿物質(zhì)，在酸性溶液提取下物質(zhì)轉(zhuǎn)為非離子化狀態(tài)，使其在水中不易解離，提高了其溶解性。試驗(yàn)結(jié)果表明用1%鹽酸水溶液提取的鉤吻堿和鉤吻堿子提取效率最高，故選用1%鹽酸水溶液作為提取溶劑。不同溶劑提取下的提取效率詳見圖3。

圖3 不同溶劑提取下的提取效率

2.2.2 凈化條件優(yōu)化

對(duì)比1%鹽酸水直接提取樣品（無凈化）、經(jīng)MCX固相萃取柱凈化和C18固相萃取柱凈化后的樣品。結(jié)果顯示，在1%鹽酸水直接提取的基礎(chǔ)上通過MCX固相萃取柱將生物堿成分富集后再凈化的效果非常明顯，C18固相萃取柱使生物堿損失量較大，生物堿含量明顯低于用MCX凈化的樣品；1%鹽酸水直接提取樣品（無凈化），則干擾物質(zhì)較多，因此不宜采用。試驗(yàn)采用MCX固相萃取柱作為凈化方式。MCX固相萃取柱以混合型強(qiáng)陽離子交換反相吸附劑為基礎(chǔ)，由PLS吸附劑鍵合磺酸基團(tuán)得到，兼具陽離子交換和反相兩種保留模式，適用于其共軛酸的pKa值處于2～10之間的堿性化合物。其保留機(jī)理以強(qiáng)陽離子交換相互作用和非極性相互作用為主，極性相互作用為次。適用于堿性化合物萃取。通過把待測物富集在MCX柱上，用水、甲醇淋洗除去試樣中的糖和酯類等非極性干擾物，用堿性溶液洗脫收集，濃縮后溶解上機(jī)測定。

2.3 方法的線性范圍及檢出限、定量限

2.3.1 方法線性

鉤吻堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液工作曲線在14～284 μg/kg（質(zhì)量濃度1.4～28.4 ng/mL）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程y=5 116.072 769x-1 015.616 631，相關(guān)系數(shù)R=0.999；鉤吻堿子標(biāo)準(zhǔn)品溶液工作曲線在10～200 μg/kg（質(zhì)量濃度1.0～20.0 ng/mL）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程y=644.826 518x-56.355 908，相關(guān)系數(shù)R=0.999。

2.3.2 方法的檢出限、定量限

以加標(biāo)試驗(yàn)來進(jìn)行方法靈敏度的確定。以鉤吻堿、鉤吻堿子定性離子信噪比≥3來確定檢出限，經(jīng)試驗(yàn)鉤吻堿檢出質(zhì)量濃度可達(dá)到0.28 ng/mL，鉤吻堿子檢出質(zhì)量濃度可達(dá)到0.2 ng/mL。以鉤吻堿、鉤吻堿子定量離子信噪比≥10來確定定量限，經(jīng)試驗(yàn)鉤吻堿檢出質(zhì)量濃度可達(dá)到0.56 ng/mL，鉤吻堿子檢出質(zhì)量濃度可達(dá)到0.4 ng/mL。最終確定稱樣量1.00 g，稀釋倍數(shù)10時(shí)，方法鉤吻堿檢出限為2.8 μg/kg、鉤吻堿子檢出限為2.0 μg/kg；鉤吻堿定量限為5.6 μg/kg、鉤吻堿子定量限為4.0 μg/kg。

2.4 回收率及精密度試驗(yàn)

2.4.1 回收率試驗(yàn)

鉤吻堿在28～280 μg/kg、鉤吻堿子在20～200 μg/kg（蜂蜜基質(zhì)）低、中、高3個(gè)加標(biāo)濃度回收率詳見表3，該試驗(yàn)中回收率試驗(yàn)的RSD均小于5%，說明方法準(zhǔn)確度高。

表3 鉤吻堿、鉤吻堿子在蜂蜜基質(zhì)中的回收率

2.4.2 精密度試驗(yàn)

鉤吻堿在28～70 μg/kg、鉤吻堿子在20～50 μg/kg（蜂蜜基質(zhì)）低、中、高3個(gè)加標(biāo)濃度，每個(gè)濃度平行樣品2份且連續(xù)進(jìn)樣6針，計(jì)偏差，鉤吻堿的蜂蜜基質(zhì)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～3.0%，鉤吻堿子的蜂蜜基質(zhì)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%～2.7%。該試驗(yàn)中基質(zhì)的精密度試驗(yàn)RSD均小于5%，說明儀器精密度良好。結(jié)果詳見表4。

表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.5 基質(zhì)效應(yīng)考察

基質(zhì)效應(yīng)（ME）是指在樣品測試過程中，目標(biāo)化合物以外的其他物質(zhì)直接或間接影響質(zhì)譜檢測的現(xiàn)象。一般采用空白樣品前處理凈化后添加標(biāo)準(zhǔn)品的方法來評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。|ME|≤10%，提示基質(zhì)效應(yīng)較小，可用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量；10%＜|ME|≤50%，提示基質(zhì)效應(yīng)較大，若用溶劑外標(biāo)法定量回收率達(dá)不到要求，則需要用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量以消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果的影響；|ME|＞50%，提示基質(zhì)效應(yīng)很強(qiáng)，嚴(yán)重影響定量，需要重新優(yōu)化樣品前處理方法。

將空白基質(zhì)試樣按標(biāo)準(zhǔn)前處理方法進(jìn)行提取、凈化后獲得空白基質(zhì)提取液，分別使用空白基質(zhì)提取液和50%甲醇水（含0.1%甲酸）溶劑將鉤吻堿和鉤吻堿子配制成質(zhì)量濃度2，8和20 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液；進(jìn)行檢測，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果均在95%～105%范圍內(nèi)，說明經(jīng)方法提取和凈化后，基質(zhì)效應(yīng)不明顯，故標(biāo)準(zhǔn)曲線用50%甲醇水（含0.1%甲酸）溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)系列濃度也適用于該標(biāo)準(zhǔn)的檢測。考察結(jié)果詳見表5。

表5 基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

稱取蜂蜜基質(zhì)各5份1.00 g樣品置于離心管中，分別加入標(biāo)準(zhǔn)液使鉤吻堿含量為280 μg/kg，鉤吻堿子含量為200 μg/kg。按2.2前處理方法，提取，凈化并檢測。結(jié)果顯示，蜂蜜基質(zhì)中鉤吻堿的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%，鉤吻堿子的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%。該試驗(yàn)中蜂蜜基質(zhì)的重復(fù)性試驗(yàn)RSD均小于5%，說明方法重現(xiàn)性良好。詳見表6。

表6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與結(jié)論

由于鉤吻含鉤吻堿、鉤吻堿子等生物堿，其可在酸性條件下形成非離子狀態(tài)，更容易溶解于水中，繼而經(jīng)過與強(qiáng)陽離子交換反相吸附劑固相萃取柱的作用吸附，用水與有機(jī)相淋洗除去雜質(zhì)后，用堿性溶液洗脫，收集洗脫液，可達(dá)到凈化的作用。

斷腸草中毒起病快，按中毒量的多少臨床表現(xiàn)，所以以臨床癥狀、表現(xiàn)判斷是否鉤吻中毒有一定的難度[1-8]，且對(duì)于中毒的劑量分析、分析速度和準(zhǔn)確性都極為重要。監(jiān)測鉤吻生物堿常見的主要方法有薄層色譜法[9]、氣相色譜法[10]、液相色譜法[11]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[12-13]、氣相色譜-二級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用[14]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[15]，由于超高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)儀為實(shí)驗(yàn)室常配儀器，根據(jù)歐盟委員會(huì)2002/657/EC決議的“四分法原則”，超高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法選取一個(gè)母離子和兩個(gè)子離子可得到較好的定性，同時(shí)該方法也是常用的定量方法，經(jīng)方法適用性考察后，該方法的定性與定量效果也能滿足日常使用要求，且該方法的檢出限與定量限設(shè)定遠(yuǎn)低于鉤吻堿和鉤吻堿子的經(jīng)口攝入中毒劑量，能滿足食品中鉤吻堿和鉤吻堿子的常量與痕量分析，超高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法在準(zhǔn)確度、靈敏度、檢測速度均優(yōu)于上述多種方法，更適合斷腸草中毒的應(yīng)急檢驗(yàn)。經(jīng)優(yōu)化，最終選用試樣經(jīng)1%鹽酸超聲提取，經(jīng)MCX柱凈化后，運(yùn)用超高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法對(duì)食品中鉤吻堿和鉤吻堿子進(jìn)行定性和定量測定。