堿性蛋白酶酶解荷葉蛋白制備多肽的工藝

李偉民，周海燕，鄭麗娟，余小娜，魏泉增

1. 許昌學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南省食品安全生物標(biāo)識(shí)快檢技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（許昌 461000）；2. 鄢陵縣市場(chǎng)監(jiān)督管理局（許昌 461200）

荷葉是一種有根莖的水生植物，屬睡蓮科。荷葉在中國(guó)許多地區(qū)均有種植，如浙江、江蘇、湖南等地[1]。荷葉資源的利用主要針對(duì)荷葉中含有大量的維生素C和原荷葉堿、荷葉堿等多種生物堿[2]。這些物質(zhì)可用于治療燥熱渴悶、暑濕泄瀉、便血崩漏[3]等癥狀，還具有保肝護(hù)肝[4]、消炎[5]等功效。荷葉中同時(shí)還含有豐富的蛋白質(zhì)[6]，為更好地利用荷葉蛋白資源，酶解制備多肽工藝十分必要。

蛋白經(jīng)過(guò)蛋白酶酶解后，得到的多肽與相應(yīng)的蛋白相比，更加容易通過(guò)小腸黏膜被機(jī)體吸收[7]，從而具有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[8]。多肽由2～16個(gè)氨基酸組成[9]，具有多種生物活性，如抑菌性[10]、免疫性[11]、和抗氧化性[12]等方面。

大多數(shù)制備多肽的工藝都是以大豆、大米等糧食作物為原料。隨著全球人口數(shù)量日益增多，對(duì)食物的需求量也逐漸增大，大米、玉米、小麥等主要糧食作物的進(jìn)口量都在成倍增長(zhǎng)[13]。對(duì)新型蛋白質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)利用具有廣闊前景。荷葉干粉中的蛋白質(zhì)含量達(dá)22.9%[14]，對(duì)荷葉蛋白資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用，具有重要的研究意義。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

荷葉粉；堿性蛋白酶（酶活力20萬(wàn) U/g，天津市諾奧科技發(fā)展有限公司）；其他試劑（均為國(guó)產(chǎn)分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2014B分析天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；TDL-60B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；T6可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；Dk-8D水浴鍋（常州普天儀器制造有限公司）；PHS-3C型pH計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）；DL-1型電爐（中興偉業(yè)儀器有限公司）；750t型粉碎機(jī)（鶴壁市天冠儀器儀表有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酶解工藝

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的荷葉粉與反應(yīng)容器中，依照蛋白酶添加量加入堿性蛋白酶溶液，調(diào)整到預(yù)設(shè)pH，緩慢攪拌，酶解過(guò)程中注意維持酶解系統(tǒng)pH恒定。酶解結(jié)束后將酶液迅速置于沸水中滅酶10 min。冷卻至室溫后以4 000 r/min離心10 min，收集上清液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

多肽含量測(cè)定方法采用雙縮脲法[15]。準(zhǔn)確稱(chēng)量1.000 g酪蛋白，用30 mL 10% NaOH溶液溶解，溶解后，用蒸餾水定容至100 mL，得到10 mg/mL酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別在6支試管中加入0，0.1，0.3，0.5，0.7和0.9 mL酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，用蒸餾水補(bǔ)齊至1.0 mL，分別加入4 mL雙縮脲試劑于6支試管中，充分混合均勻，在室溫下反應(yīng)30 min，在540 nm處比色測(cè)定。

1.3.3 多肽濃度測(cè)定

將收集到的上清液定容至100 mL，搖勻移取溶液10 mL至離心管中，以4 000 r/min離心5 min，使上清液澄清，吸取上清液1 mL，并和4 mL雙縮脲試劑混合，以蒸餾水為空白，室溫下溶液反應(yīng)30 min，測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)系式，計(jì)算溶液濃度。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

確定堿性蛋白酶添加量（1 000，1 500，2 000，2 500和3 000 U/g），酶解溫度（40，45，50，55和60 ℃），酶解時(shí)間（2，3，4，5和6 h），酶解pH（7.0，8.0，9.0，10.0和11.0）4個(gè)因素，分別對(duì)溶液中多肽含量的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果探索最適酶解時(shí)間、最適酶解pH、最適酶解溫度、最適堿性蛋白添加量的基礎(chǔ)上，選取其中的酶解時(shí)間、酶解pH、酶解溫度作響應(yīng)面綜合分析。采用Design-Expert 8.0.6軟件中心組合試驗(yàn)進(jìn)行多肽含量提取最佳工藝。試驗(yàn)方案見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素和水平

2 結(jié)果與分析

2.1 酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

以酪蛋白含量為橫坐標(biāo)，吸光度作為縱坐標(biāo)，酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。回歸方程為：y=0.043 5x+0.000 9，R2=0.999 9。

圖1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 堿性蛋白酶添加量對(duì)酶解效果的影響

堿性蛋白酶添加量對(duì)酶解液中多肽含量的影響如圖2所示。隨著蛋白酶添加量的增加，溶液中多肽含量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)。酶添加量1 000 U/g的條件下多肽含量最低，隨著蛋白酶添加量增加，水解度不斷增大。堿性蛋白酶添加量2 000 U/g時(shí)，多肽含量最高，隨著蛋白酶量繼續(xù)增加，多肽含量降低。當(dāng)酶濃度過(guò)高時(shí)，酶分子間可能相互水解，導(dǎo)致酶解效果下降[16]。也可能由于蛋白質(zhì)的過(guò)度水解破壞了肽鍵，產(chǎn)生氨基酸，使多肽的含量減少。

2.2.2 酶解時(shí)間對(duì)酶解液中多肽含量的影響

酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響如圖3所示。荷葉多肽的含量呈現(xiàn)出先上升后下降趨勢(shì)，酶解2 h條件下多肽含量最低，隨著時(shí)間的增加，荷葉多肽含量隨之增加。荷葉在酶解時(shí)間5 h時(shí)多肽含量最大。隨著酶解時(shí)間繼續(xù)增加，荷葉多肽含量下降，酶解時(shí)間6 h時(shí)，酶解液中多肽含量最低，這可能是由于隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶濃度逐漸減小，活性逐漸下降，最終失活。酶解最適時(shí)間為5 h。

圖2 堿性蛋白酶添加量對(duì)荷葉多肽含量的影響

圖3 酶解時(shí)間對(duì)荷葉多肽含量的影響

2.2.3 溫度對(duì)酶解液中多肽含量的影響

溫度對(duì)酶解液中多肽含量的影響如圖4所示。溫度從40 ℃升至60 ℃過(guò)程中，荷葉多肽得率呈現(xiàn)出先上升后下降趨勢(shì)。在40 ℃條件下荷葉多肽的含量最低，溫度升至55 ℃時(shí)荷葉多肽的得率達(dá)到最大值。繼續(xù)升高溫度，多肽含量反而下降。溫度偏高或偏低會(huì)抑制堿性蛋白酶的活性，溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致堿性蛋白酶逐漸失活，影響酶解效果，堿性蛋白酶酶解荷葉蛋白的最適溫度在55 ℃。

圖4 酶解溫度對(duì)荷葉多肽含量的影響

2.2.4 酶解pH對(duì)酶解液中多肽含量的影響

酶解pH對(duì)酶解液中多肽含量的影響如圖5所示。在pH 7.0～11.0過(guò)程中，荷葉多肽的得率呈現(xiàn)出先增加后減小趨勢(shì)。pH 7.0時(shí)荷葉多肽的含量最低。pH 9.0時(shí)，荷葉多肽的得率達(dá)到最大值。隨著pH繼續(xù)增大，由于環(huán)境條件的pH超過(guò)酶的最適pH，限制酶的活性，所以酶解液中的多肽含量也隨之下降。堿性蛋白酶酶解荷葉蛋白的最適pH為9.0。

圖5 酶解pH對(duì)荷葉多肽含量的影響

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面法試驗(yàn)分析及結(jié)果

從4個(gè)單因素結(jié)果中選取酶解時(shí)間（A）、酶解pH（B）、酶解溫度（C）這3個(gè)因素作為參考依據(jù)，以多肽含量為指標(biāo)。進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，確定堿性蛋白酶水解制備荷葉多肽的最佳工藝條件。響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3.2 方差分析

通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立多元二次響應(yīng)面回歸模型為：R=13.15-0.069A-0.13B-0.015C-0.046AB+0.031AC-0.061BC-0.29A2-0.29B2-0.27C2。由表3可以看出模型達(dá)到極顯著（p＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），表明方程無(wú)失擬性因素存在，回歸模型與實(shí)際值能較好的擬合。一次項(xiàng)A、B表現(xiàn)為極顯著，二次項(xiàng)A2、B2、C2表現(xiàn)為極顯著，說(shuō)明他們對(duì)響應(yīng)值影響極大。由F檢驗(yàn)可以得到影響因素主次排序?yàn)椋好附鈖H（B）、酶解時(shí)間（A）和酶解溫度（C）。

表3 回歸分析結(jié)果

圖6直觀反映不同兩因素之間的交互作用對(duì)多肽含量的影響，曲面越彎曲，兩因素交互作用對(duì)多肽含量的影響越顯著[17]。由表4可知，其中因素BC對(duì)酶解效果影響極顯著（p＜0.01），AB對(duì)酶解效果影響顯著（p＜0.05），AC對(duì)多肽含量的影響不顯著（p＞0.05）。

圖6 不同兩因素之間交互作用對(duì)酶解液中多肽含量的影響

2.4 荷葉蛋白酶解工藝的確定及優(yōu)化工藝條件驗(yàn)證

經(jīng)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，Design-Expert 8.0.6軟件分析得出最優(yōu)條件為：酶解pH 8.78，酶解時(shí)間4.9 h，酶解溫度54.9 ℃。此條件下酶解液中多肽含量為13.164 8 mg/mL。將工藝參數(shù)調(diào)整為：酶解時(shí)間4.9 h，酶解溫度54.9 ℃，酶解pH 8.78。在此工藝測(cè)定的多肽含量為13.158 6 mg/mL。與理論條件下的多肽含量較為接近。試驗(yàn)可以證明模型可靠，方程能夠比較真實(shí)地反映各因素對(duì)多肽含量影響的實(shí)際情況。通過(guò)軟件建造的模型也能真實(shí)直觀地反映情況，模型與實(shí)際情況貼近吻合，響應(yīng)面的數(shù)據(jù)處理真實(shí)有效。

3 結(jié)論

荷葉中蛋白質(zhì)的含量較高，并且荷葉價(jià)格低廉。通過(guò)酶解的方法制備荷葉多肽，條件溫和，無(wú)化學(xué)試劑殘留，對(duì)人體無(wú)害。試驗(yàn)探討了在單因素基礎(chǔ)上，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)荷葉蛋白酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，荷葉多肽制備的最優(yōu)條件為：加酶量2 000 U/g，酶解pH 8.78，酶解溫度54.9 ℃，酶解時(shí)間4.9 h。在此條件下，測(cè)得溶液中多肽的含量最高，與預(yù)測(cè)值兩者之間相對(duì)誤差為0.05%。為利用中國(guó)荷葉蛋白資源，提高荷葉附加值提供基礎(chǔ)。