大孔樹脂分離純化木二糖技術(shù)

隋明 *，周文 ，謝慧蓉，李俊儒，張鳳英

1. 四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院（都江堰 611830）；2. 四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院（成都 610065）

小麥?zhǔn)侵袊闹饕r(nóng)作物，資源十分豐富但利用率的程度很低，在加工面粉后殘留的小麥麩皮含有豐富的纖維素[1]和半纖維素[2]，可以利用高溫蒸煮法[3]、蒸汽爆破法[4]、超聲波輔助法[5]來生產(chǎn)和制備低聚木糖。低聚木糖糖漿的主要成分是木糖、木二糖、木三糖及少量的聚合度更高（≤8）的寡糖[6-7]，其中木二糖和木三糖是最為有效的成分[8]，含量越高，則低聚木糖產(chǎn)品的品質(zhì)越高。低聚木糖作為目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的超強(qiáng)因子，而二糖和三糖的促進(jìn)雙歧桿菌的能力最強(qiáng)[9]。關(guān)于低聚木糖的提取技術(shù)趨近成熟[10]，而木二糖的分離純化的工藝還有待進(jìn)一步研究，目前主要采用葡聚糖凝膠通過分子量的大小進(jìn)行洗脫分離[11]。樹脂分離技術(shù)作為一種綠色環(huán)保、高效的分離純化技術(shù)，近些年被廣泛應(yīng)用于中草藥[12]功能性成分、糖類[13]、蛋白[14]和核酸類[15]物質(zhì)的提取分離以及研究的開發(fā)中。試驗(yàn)在比較了幾種樹脂對木二糖的靜態(tài)吸附與解吸效果并篩選最優(yōu)樹脂的基礎(chǔ)上，以木二糖的得率與純度為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化最優(yōu)樹脂下不同流速、不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對木二糖柱分離的梯度洗脫技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器設(shè)備

1.1.1 材料

D-（+）-木糖（色譜純，北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司）；乙腈（色譜純，天津市科密歐化學(xué)實(shí)際開發(fā)中心）；無水乙醇（沈陽泉瑞試劑有限公司）；P-Ca樹脂（上海樹脂廠）；ZA-Ca樹脂（浙江樹脂廠）；L-Na樹脂（美國羅門哈斯公司）；分子篩樹脂（上海樹脂廠）；低聚木糖（山東龍力有限責(zé)任公司）；木二糖（色譜純，日本三得利公司）。

1.1.2 儀器

層析柱（1 000 mm×15 mm）；恒流泵、全自動(dòng)部分收集器（上海滬西分析儀器廠）；WZ-112型手持式折射儀（北京萬成北增精密儀器有限公司）；高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用低聚木糖糖漿上樣，通過靜態(tài)吸附與動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)確定吸附木二糖能力最佳的樹脂，通過單因素試驗(yàn)對吸附條件進(jìn)行優(yōu)化。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)流程：低聚木糖糖漿→樹脂的靜態(tài)吸附和動(dòng)態(tài)吸附比較→篩選出最佳吸附木二糖的樹脂→最佳樹脂下的動(dòng)態(tài)吸附與解吸比較→不同流速下不同乙醇體積分?jǐn)?shù)動(dòng)態(tài)梯度洗脫比較→最優(yōu)流速下不同乙醇體積分?jǐn)?shù)動(dòng)態(tài)梯度洗脫比較→木二糖層析柱分離最佳的技術(shù)參數(shù)。

1.2.2 試驗(yàn)方法

1.2.2.1 樹脂預(yù)處理

原生態(tài)樹脂使用之前需要進(jìn)行預(yù)處理，因?yàn)闃渲谐３：形淳酆系膯误w、致孔劑、分散劑、等有機(jī)殘留物質(zhì)，為了提高樹脂的潔凈程度，需要用去離子水浸泡樹脂24～36 h，乙醇浸泡24 h，采用去離子水將樹脂洗凈，反復(fù)洗滌樹脂直到乙醇體積分?jǐn)?shù)小于1%。舊樹脂的處理順序：用4%氫氧化鈉浸泡24 h，用去離子水洗至中性，用4%的鹽酸浸泡，用去離子水水清洗至中性。

1.2.2.2 不同樹脂靜態(tài)吸附與解吸效果比較

取30 g無明顯游離水附著的樹脂置于250 mL三角瓶中，加入100 mL 5%低聚木糖糖漿，將三角瓶置于轉(zhuǎn)速140 r/min的振蕩儀上振蕩，使樹脂充分吸附飽和，12 h后從三角瓶中吸取10 mL左右的液體保留以待測定，倒出三角瓶內(nèi)剩余溶液，依次加入500 mL不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，將樹脂在轉(zhuǎn)速140 r/min的振蕩儀進(jìn)行解吸，得到解吸液。采用高效液相色譜法對糖漿原液、吸附后保留液、解吸液進(jìn)行定量定性分析，并計(jì)算靜態(tài)吸附率和解吸率。

1.2.2.3 最優(yōu)樹脂動(dòng)態(tài)分離純化木二糖參數(shù)優(yōu)化

樹脂動(dòng)態(tài)吸附與洗脫采用濕法裝柱，樹脂柱體積200 mL，在裝柱的時(shí)候樹脂始終保持濕潤，取保藏的濕潤樹脂（失水樹脂不能再使用），在裝柱時(shí)不能產(chǎn)生氣泡，會影響對糖漿的吸附，裝柱后用水沖洗3～5 BV（樹脂床體積），以壓緊樹脂和排除氣泡。將20 mL 50%低聚木糖糖液加入層析柱，待糖液完全進(jìn)入樹脂中并且最上層樹脂仍然保持濕潤，保持一段吸附時(shí)間，用0.5，1.0，1.5和2 BV的流速，用5%，10%，20%和30%乙醇梯度洗脫，每5 BV轉(zhuǎn)換一個(gè)梯度，檢測洗脫液中的木二糖含量，計(jì)算其得率與純度。

1.3 檢測方法

1.3.1 還原糖含量的測定

采用DNS法測定還原糖。參照GB/T 5009.7—2016[16]。

1.3.2 總糖含量的測定

采用苯酚-硫酸測定總糖。參照GB/T 15672—2009[17]。

1.3.3 木二糖含量的測定

參照QB/T 2984—2008[18]和GB/T 35545—2017[19]中的低聚木糖測定方法中的單組份方法，采用高效液相色譜法測定木二糖，當(dāng)以質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）計(jì)算木二糖含量時(shí)，以木糖為標(biāo)準(zhǔn)（數(shù)值為1），木二糖的換算系數(shù)為0.93。色譜柱Sugarks-801；流動(dòng)相為超純水；柱溫50 ℃；檢測器為RID-6A示差折光檢測器；分析條件：流速1 mL/min，流動(dòng)相為高純水，溫度60 ℃（采用HPLC分析之前，需要將樣品中的乙醇蒸出，以保護(hù)分析柱不會中毒）。

1.3.4 計(jì)算公式

吸附率=樹脂吸附木二糖的量（mg）/原料液中木二糖含量（mg）×100% （1）

吸附率=洗脫液木二糖的量（mg）/樹脂吸附木二糖的量（mg）×100% （2）

木二糖得率=洗脫液中木二糖質(zhì)量濃度（mg/mL）× 洗脫液體積（mL）/吸附低聚木糖糖漿中木二糖含量（mg）×100% （3）

通過對低聚木糖在樹脂柱的動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)得到的穿透曲線計(jì)算吸附量。當(dāng)吸附劑穿透后，可根據(jù)穿透時(shí)間，吸附劑的填裝量，進(jìn)樣量濃度等來計(jì)算出穿透吸附量，可利用計(jì)算機(jī)軟件Origin將穿透曲線積分求得的面積，再結(jié)合初始濃度、柱后流量及填裝的吸附劑的量計(jì)算出吸附劑的平衡吸附穿透吸附量，按式（4）計(jì)算。

式中：q為穿透吸附量，g/g；l為吸附柱后流量，g/mL；m為填裝活性炭的量，g；S1為圖1（C）中波峰的面積。

平衡吸附量按式（5）計(jì)算。

式中：q0為平衡吸附量，g/g；S3為圖1（C）中波峰積分面積；t0為吸附介質(zhì)吸附平衡的時(shí)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同型號樹脂對木二糖靜態(tài)吸附和解吸效果的比較

大孔樹脂純化和分離物質(zhì)的原理是根據(jù)原料中各個(gè)組分的極性、官能團(tuán)和分子量的不同而進(jìn)行的[5]。比較幾種不同樹脂對木二糖的吸附量和吸附率（如表1所示），通過對集中樹脂對木二糖吸附量和吸附率的比較，可以看出在相同條件下，Na+樹脂對木二糖吸附量最多，吸附率達(dá)到54.61%，其次為ZA-Ca樹脂，吸附率為47.57%。大孔系分子篩樹脂對其分離的效果不好，幾乎不能按照分子量將單組份分開，這主要可能因?yàn)樘穷惖姆肿恿刻?，如采用分離度更小凝膠樹脂效果都要好。采用乙醇洗脫后對木二糖洗脫量最多的仍然是Na+樹脂。因此通過靜態(tài)吸附結(jié)果表明，Na+樹脂對木二糖有較好分離純化效果，可作為木二糖動(dòng)態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)的最優(yōu)樹脂。

李清祥[20]通過使用不同的陽離子樹脂對工業(yè)乙醇進(jìn)行脫水，結(jié)果表明Ca2+、Na+型兩種陽離子樹脂比工業(yè)中常用的K+型樹脂的效果更好，能夠節(jié)約生產(chǎn)成本減少經(jīng)濟(jì)成本，這可能因?yàn)镵+的離子化傾向相對較弱且離子半徑要更大，造成吸附效果相比較差。對比試驗(yàn)效果可以看出，使用乙醇作為洗脫劑分離不同聚合度的低聚木糖時(shí)，Na+型樹脂對于水溶性的糖分子吸附性更強(qiáng)，也與試驗(yàn)結(jié)果一致。方偉明等[21]通過使用Na+樹脂吸附水中的無機(jī)鹽類物質(zhì)發(fā)現(xiàn)：通過樹脂復(fù)蘇可以將樹脂的重復(fù)利用率增加，且可以解決Na+脫落的問題，減少引入外來離子到吸附液中。張軍華等[22]使用Bio-Gel P-2凝膠作為分離介質(zhì)、超純水作為洗脫液，一次性可以分離得到2～6個(gè)聚合度的低聚木糖分子，且木二糖純度達(dá)85%以上，木五糖的純度最低超過60%。

表1 不同型號樹脂對木二糖靜態(tài)吸附與解吸效果的比較

2.2 不同流速下不同乙醇體積分?jǐn)?shù)動(dòng)態(tài)梯度洗脫Na+樹脂對吸附結(jié)果的影響

不同流速、不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫Na+樹脂吸附的低聚木糖對分離得到的木二糖純度和得率的影響如表2所示。通過單因素試驗(yàn)可知，流速1 BV/h，乙醇體積分?jǐn)?shù)10%時(shí)，洗脫液中的木二糖含量最高，純度也最高，得率也比較高，因此在此條件下進(jìn)行洗脫效果最佳。

表2 不同流速下不同乙醇體積分?jǐn)?shù)動(dòng)態(tài)梯度洗脫Na+樹脂對木二糖的影響

楊偉東[23]使用Na+陽離子交換樹脂純化葡苷聚糖結(jié)果表明，洗脫效果收流速、溫度、上樣量、樹脂填料高度影響，流速很小或者很高時(shí)，會造成不同組分發(fā)生重疊；在相同直徑條件下填充樹脂越高，各組分分離的效果越好，但是隨著高度增加分離的時(shí)間會越久。劉迪等[24]通過使用大孔樹脂分離核桃青皮萘醌類成份的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)影響吸附率的因素的先后順率為：上樣濃度＞進(jìn)樣液pH＞流速。試驗(yàn)中低聚木糖、乙醇都是中性物質(zhì)因此可以忽略pH的影響，當(dāng)上樣濃度一致，在相同流速而洗脫劑濃度不同條件下，隨著洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)逐漸增大，洗脫液中木二糖的含量呈現(xiàn)逐漸增加又降低趨勢，比解吸量逐漸降低，而木二糖純度和得率沒有規(guī)律。

圖1 不同進(jìn)樣濃度對木二糖吸附的影響

使用高效液相色譜發(fā)測定對比不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗脫液中分離出的組分，結(jié)果表明，采用10%乙醇作為流動(dòng)相洗脫被Na+樹脂吸附的低聚木糖，結(jié)果如圖1（A）顯示，在乙醇洗脫收集液中木二糖含量達(dá)90%以上，但是還含有少量的木糖，對比同批進(jìn)行分析的低聚木糖圖譜可以看出保留時(shí)間同為12.7 min左右的是木二糖。在采用部分收集器收集過程中，11～18管中都存在單一組分木二糖，在14管中含量最為穩(wěn)定，組分單一甚至可以達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)品的濃度（99%）。圖1（B）是脫液進(jìn)行的色譜分析圖（與醇洗脫液非同批次測定），含有木糖、阿拉伯糖和少量葡萄糖，根據(jù)樹脂的特性推測，采用水作為流動(dòng)相能夠洗脫下絕大部分的單糖成分，可采用此方法除去雜質(zhì)單糖。采用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇梯度洗脫，可將低聚糖洗脫下來，55%乙醇的洗脫液中不含有木糖等單糖，其成分主要是木二糖以上的寡糖。采用DNS測定總的水洗脫液中還原糖的量可知，單糖含量為2.15%。水洗脫液和醇洗脫液糖的總含量為9.17 g，醇洗脫液低聚木糖占總糖的75%。

將不同洗脫液（乙醇、水）的不同時(shí)間的洗脫液使用高效液相色譜法進(jìn)行分析，圖譜如圖1所示。

將試驗(yàn)得到的大量的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)代入式（1）和（2）進(jìn)行擬合計(jì)算，在Na+型大孔樹脂吸附木二糖的層析條件下，傳質(zhì)阻力和顆粒內(nèi)擴(kuò)散傳質(zhì)阻力同時(shí)存在。穿透曲線的形狀都是很陡峭的直上直下的波峰，說明傳質(zhì)區(qū)的大小與傳質(zhì)阻力的大小、吸附劑顆粒的大小有密切關(guān)系。穿透曲線的陡峭說明吸附穿透時(shí)，木二糖充分地被樹脂所吸附，而樹脂的吸附能力充分地被利用，這樣使得床層的利用率增高；反之，如果曲線很平緩則說明穿透時(shí)還有較多的吸附劑沒有達(dá)到飽和，床層的利用率低。所以試驗(yàn)條件較為成功，不會造成生產(chǎn)成本提高，能夠使設(shè)備效率增加。

進(jìn)樣量和進(jìn)樣濃度對洗脫液中的單體物質(zhì)分離有著重要影響，趙林果等[25]使用聚丙烯酰胺凝膠通過分子量大小分離純化低聚木糖的試驗(yàn)中表明確定洗脫速度和進(jìn)樣量可以獲得純度較高的低聚木糖，該凝膠樹脂是通過分子量大小穿入樹脂中，因其分子量大小不同造成走的路徑長短不同而被分離出來的原理，蛋白質(zhì)等大分子量的物質(zhì)在分離時(shí)最先被洗脫出來。馬永強(qiáng)等[26]使用不同類型的大孔樹脂分離樹莓酮，結(jié)果表明上樣體積對純化的效果具有較大的影響。使用大孔樹脂分離純化一些天然產(chǎn)物或者功能性物質(zhì)時(shí)，上樣體積（或者濃度、質(zhì)量單位）對于使用相同類型的樹脂的洗脫流速、柱長都有直接的影響[24,27-28]。

表3顯示的是平行樣試驗(yàn)的計(jì)算結(jié)果，床層利用率達(dá)68%左右，而試驗(yàn)操作計(jì)算只有66%左右，這主要是因?yàn)樵诨A(chǔ)數(shù)據(jù)上如層析介質(zhì)質(zhì)量稱量、流動(dòng)相的體積收集、進(jìn)樣量的濃度配制等都有不同程度的誤差。而且擴(kuò)大規(guī)模試驗(yàn)過程中需要考慮樹脂的顆粒大小、比表面積、孔分布、交聯(lián)度等，否則將不能確定層析介質(zhì)的填充量和分離度。采用試驗(yàn)的吸附計(jì)算模型對基礎(chǔ)數(shù)據(jù)進(jìn)行微分和積分計(jì)算可以簡化大量的計(jì)算工作。計(jì)算可得：吸附劑的平衡吸附穿透吸附量0.3 g/g，平衡吸附量0.18 g/g。理論的數(shù)據(jù)符合試驗(yàn)測得的數(shù)據(jù)，說明采用模型進(jìn)行計(jì)算活性炭對木二糖的吸附能力是可行的。

表3 不同進(jìn)樣濃度對木二糖吸附的影響

3 結(jié)論

Na樹脂是幾種樹脂中分離純化木二糖的最佳樹脂，最佳參數(shù)：流速為0.8 BV，經(jīng)過2 BV的10%乙醇進(jìn)行梯度洗脫的木二糖、總得率和總純度分別為4.78 mg，62.8%和5.7%。