纖維素酶法提取佛手山藥多糖的工藝

喻隨，鄧霞，陳思穎，吳鵬，占劍峰，胡婷*

黃岡師范學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)資源學(xué)院，經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心（黃岡 438000）

佛手山藥產(chǎn)于湖北黃岡市蘄春、武穴等地，因其形狀似手掌而得名[1]。作為湖北省黃岡市的特色經(jīng)濟(jì)作物，佛手山藥被農(nóng)業(yè)部登記為“農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志產(chǎn)品”[2]。它是一種藥食同源食物，具有強(qiáng)筋骨、健脾臟、除濕、益腎等作用。據(jù)報(bào)道，佛手山藥含有多種營(yíng)養(yǎng)成分，如多糖、多酚、皂苷等，其中多糖是主要活性成分之一，研究表明佛手山藥多糖具有降血脂、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、抗病變等活性[3-4]。因此，從佛手山藥中提取多糖具有重要的研究?jī)r(jià)值。

目前，國(guó)內(nèi)常用的提取山藥多糖的方法有水提法[5]、微波輔助法[6]、超聲波輔助法[7-8]、酶法[9]等。與水提法相比，酶法提取能使多糖迅速釋放；與超聲波和微波輔助提取法相比，酶法提取條件溫和，避免多糖因?yàn)闇囟冗^高而導(dǎo)致的降解[10]。纖維素酶作為一種常用于植物多糖提取的酶，能夠有效地破壞山藥的細(xì)胞壁，加速其中水溶性多糖溶出的速率，可以極大縮短提取時(shí)間，提高多糖的提取率[9]。目前關(guān)于纖維素酶提取佛手山藥多糖的研究甚少，因此此次試驗(yàn)采用纖維素酶從佛手山藥中提取多糖，并通過響應(yīng)面法確定最佳提取條件，以期提高佛手山藥多糖的提取率，為佛手山藥功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

佛手山藥（市售）；葡萄糖（AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；苯酚（AR，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）；濃硫酸（AR，中國(guó)平煤神馬集團(tuán)開封東大化工有限公司）；纖維素酶（酶活力≥1 5000 U/g，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.1.2 儀器與設(shè)備

高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（FW-100，北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）；臺(tái)式高速離心機(jī)（H/T18MM，湖南赫西儀器裝備有限公司）；可見分光光度計(jì)（V-5600，上海元析儀器有限公司）；電子天平（CP413）：奧豪斯儀器（常州）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 佛手山藥多糖的提取

稱取1.00 g佛手山藥粉末于錐形瓶，加入一定量的纖維素酶，按料液比1∶20（g/mL）添加超純水，搖勻后，放入恒溫水浴鍋中進(jìn)行酶解，酶解結(jié)束后，放入100 ℃沸水中滅活10 min，冷卻至室溫，在5 000 r/min下離心10 min，上清液即為佛手山藥粗多糖溶液。

1.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取9支試管并編號(hào)，依次精確吸取0.0，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6和1.8 mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液于試管中，再加超純水至總體積為2.0 mL，接著加入1.0 mL 6%苯酚和5.0 mL濃硫酸，搖勻后，室溫靜置20 min，以1號(hào)試管作為空白對(duì)照，在490 nm下測(cè)定各試管的吸光度，以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)測(cè)定，回歸曲線方程為y=0.012 7x+0.116 9，R2=0.999 6。

1.2.3 佛手山藥多糖提取率的測(cè)定

取2.0 mL佛手山藥粗多糖溶液，采用1.2.2的方法測(cè)定溶液中總糖的含量，并按式（1）計(jì)算佛手山藥多糖的提取率。

式中：X為樣品中多糖提取率，%；c為待測(cè)液的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為待測(cè)液的體積，mL；f為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

1.2.4.1 酶解時(shí)間對(duì)佛手山藥多糖提取率的影響

稱取6份佛手山藥粉末，各1.0 g，加入2%纖維素酶，按料液比1∶20（g/mL）加入超純水，分別設(shè)置酶解時(shí)間10，20，30，40，50和60 min，在40 ℃下進(jìn)行酶解。

1.2.4.2 加酶量對(duì)佛手山藥多糖提取率的影響

稱取5份佛手山藥粉末，各1.0 g，按料液比1∶20（g/mL）加入超純水，分別設(shè)置加酶量1%，2%，3%，4%和5%，在40 ℃下酶解20 min。

1.2.4.3 酶解溫度對(duì)佛手山藥多糖提取率的影響

稱取5份佛手山藥粉末，各1.0 g，加入2%纖維素酶，按料液比1∶20（g/mL）加入超純水，分別設(shè)置酶解溫度35，40，45，50和55 ℃，酶解20 min。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以佛手山藥多糖提取率為響應(yīng)面（Y），選取酶解時(shí)間（A）、加酶量（B）及酶解溫度（C）為影響因素，運(yùn)用Design-Expert 8.0.6.0軟件進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的設(shè)計(jì)，響應(yīng)面因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對(duì)佛手山藥多糖提取率的影響

2.1.1 酶解時(shí)間對(duì)佛手山藥多糖提取率的影響

酶解時(shí)間對(duì)佛手山藥多糖提取率的影響如圖1所示。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，佛手山藥多糖提取率先升高后降低。當(dāng)酶解時(shí)間為20 min時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大；當(dāng)酶解時(shí)間低于20 min時(shí)，多糖提取率較低；當(dāng)酶解時(shí)間大于20 min時(shí)，多糖提取率逐漸減小，原因可能是隨著時(shí)間延長(zhǎng)造成多糖結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致提取率降低[6]。由此可得最佳酶解時(shí)間為20 min。

圖1 酶解時(shí)間對(duì)佛手山藥多糖提取率的影響

2.1.2 加酶量對(duì)佛手山藥多糖提取率的影響

加酶量對(duì)佛手山藥多糖提取率的影響如圖2所示。隨著加酶量的增加，佛手山藥多糖提取率先升高后降低。當(dāng)加酶量為2%時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大；當(dāng)酶解時(shí)間大于2%時(shí)，多糖提取率逐漸減小，可能的原因是在加酶量較低時(shí)酶可以和底物充分接觸，所以隨著酶的增加，提取率逐漸上升，但酶增加至一定量時(shí)，底物會(huì)被反應(yīng)完全，酶的活性被抑制，提取率反而下降[11]。由此可得最佳加酶量為2%。

圖2 加酶量對(duì)佛手山藥多糖提取率的影響

2.1.3 酶解溫度對(duì)佛手山藥多糖提取率的影響

酶解溫度對(duì)佛手山藥多糖提取率的影響如圖3所示。隨著酶解溫度的升高，佛手山藥多糖提取率先升高后降低。當(dāng)酶解溫度為40 ℃時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大；當(dāng)酶解溫度高于40 ℃時(shí)，多糖提取率逐漸減小，溫度過高會(huì)破壞酶的結(jié)構(gòu)，降低酶的活性，導(dǎo)致山藥多糖的提取率降低[12]。由此可得最佳酶解溫度為40 ℃。

圖3 酶解溫度對(duì)佛手山藥多糖提取率的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)表2中各單因素與佛手山藥多糖提取率（Y）進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸分析，得到回歸方程：Y=21.93-0.35A+2.4B-0.23C+0.83AB-0.32AC-0.5BC-5.5A2-3.32B2-3C2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

響應(yīng)面回歸模型方差分析結(jié)果見表3。結(jié)果顯示：該模型p＜0.000 1，說明該模型極顯著；失擬項(xiàng)p=0.822 8＞0.05，不顯著，即模型與試驗(yàn)值的差異較?。幌嚓P(guān)系數(shù)R2=0.997 1＞0.9，說明該模型的擬合度較好，試驗(yàn)誤差?。恍Ｕ嚓P(guān)系數(shù)R2Adj=0.993 3，說明該模型能解釋99.33%響應(yīng)值的變化[13-14]。方差分析結(jié)果表明，影響佛手山藥多糖提取率的主次順序依次為加酶量（B）、酶解時(shí)間（A）和酶解溫度（C）。在回歸方程中，B、A2、B2和C2對(duì)Y值影響極其顯著（p＜0.000 1），A、AB和BC對(duì)Y值影響顯著（p＜0.05），C和AC對(duì)Y值影響不顯著（p＞0.05）。

表3 響應(yīng)面回歸模型結(jié)果方差分析

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析和提取工藝優(yōu)化

各因子交互作用響應(yīng)面分析表示，圖中因素的邊線越陡說明該因素對(duì)多糖提取率的影響越大[15]。等高線圖越接近橢圓，說明兩因素交互作用對(duì)佛手山藥多糖提取率的影響越大[16]。通過圖4～圖6可對(duì)提取過程中因素的相互作用及對(duì)佛手山藥多糖提取率的影響進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)，從而確定佛手山藥多糖提取的最佳條件。圖4為固定酶解溫度為0水平時(shí)，加酶量和酶解時(shí)間及二者之間的交互作用對(duì)佛手山藥多糖提取率的影響?？梢钥闯觯号c酶解時(shí)間（A）方向比較，加酶量（B）響應(yīng)面曲線較陡，說明對(duì)佛手山藥多糖提取率的影響大小為加酶量＞酶解時(shí)間。圖5為固定加酶量為0水平時(shí)，酶解時(shí)間和酶解溫度及二者之間的交互作用對(duì)佛手山藥多糖提取率的影響?？梢钥闯觯号c酶解溫度（C）方向比較，酶解時(shí)間（A）響應(yīng)面曲線較陡，說明對(duì)佛手山藥多糖提取率的影響大小為酶解時(shí)間＞酶解溫度。圖6為固定酶解時(shí)間為0水平時(shí)，加酶量和酶解溫度及二者之間的交互作用對(duì)佛手山藥多糖提取率的影響。可以看出：與酶解溫度（C）方向比較，加酶量（B）響應(yīng)面曲線較陡，說明對(duì)佛手山藥多糖提取率的影響大小為加酶量＞酶解溫度。以上結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

2.3 模型驗(yàn)證

利用Design-Expert 8.0.6.0軟件進(jìn)行分析得到最優(yōu)的提取條件：酶解時(shí)間20.58 min、加酶量2%、酶解溫度39.67 ℃，在此條件下多糖提取率為22.39%。考慮試驗(yàn)的可操作性，在實(shí)際的試驗(yàn)中調(diào)整工藝參數(shù)為酶解時(shí)間21 min、加酶量2%、酶解溫度40 ℃，在此條件下做3次平行試驗(yàn)，佛手山藥多糖提取率為22.23%，此結(jié)果與預(yù)測(cè)值22.39%接近，說明此模型可靠，適用于佛手山藥多糖提取工藝的優(yōu)化。

圖4 酶解時(shí)間與加酶量對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面圖

圖5 酶解時(shí)間和酶解溫度對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面圖

圖6 加酶量與酶解溫度對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面圖

3 結(jié)論

通過纖維素酶酶解法提取佛手山藥多糖工藝的研究，得到了佛手山藥多糖提取的最佳提取條件，即酶解時(shí)間21 min、加酶量2%、酶解溫度40 ℃。在此條件下，佛手山藥多糖的提取率為22.23%。纖維素酶能夠有效破壞佛手山藥的細(xì)胞壁，極大縮短佛手山藥多糖溶出的時(shí)間，提高佛手山藥多糖的提取率，為佛手山藥多糖的生理活性研究提供理論依據(jù)，對(duì)佛手山藥多糖相關(guān)保健品的開發(fā)具有重要的意義。