干擾SNHG7對(duì)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響

任永強(qiáng) 李慶華 黃新建

(河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，洛陽 471003)

瘢痕疙瘩是良性皮膚腫瘤，影響患者外觀、損害患者身心健康，主要表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞的異常增殖及膠原過量沉積[1]。瘢痕疙瘩的治療方法主要為手術(shù)、放化療及激光治療等，但療效不甚滿意，藥物綜合治療成為研究熱點(diǎn)，闡明瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制有利于新靶向藥物的開發(fā)[2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)不僅參與細(xì)胞生長、發(fā)育等過程，還參與調(diào)控纖維化多種生物學(xué)過程，有望成為器官纖維化診斷和預(yù)后的分子標(biāo)志物及藥物作用新靶點(diǎn)[3]。小核仁RNA宿主基因7(small nucleolar RNA host gene 7，SNHG7)隸屬于lncRNA，在多種腫瘤中高表達(dá)，發(fā)揮致癌基因作用，如SNHG7在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，促進(jìn)其增殖、侵襲和遷移，在食管癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，促進(jìn)食道癌細(xì)胞增殖并抑制凋亡，在胃癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，干擾其表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4-6]。但SNHG7在瘢痕疙瘩中的表達(dá)及其對(duì)瘢痕疙瘩的影響尚未闡明。研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與皮膚疾病和創(chuàng)傷修復(fù)的發(fā)生發(fā)展，瘢痕疙瘩中異常表達(dá)的miRNA參與增生性瘢痕形成[7]。miR-122修飾可增強(qiáng)脂肪組織間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肝纖維化的治療功效[8]。miR-122在胃癌組織和細(xì)胞系中均低表達(dá)，與患者侵襲性臨床病理特征顯著相關(guān)，miR-122過表達(dá)明顯抑制胃癌細(xì)胞系增殖、侵襲和遷移[9]。盧玲[10]用miRNA基因芯片技術(shù)檢測瘢痕疙瘩與正常皮膚組織差異表達(dá)的miRNA基因，發(fā)現(xiàn)miR-122在瘢痕疙瘩中表達(dá)下調(diào)，說明miR-122可能與瘢痕疙瘩發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但miR-122對(duì)瘢痕疙瘩的影響尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)研究SNHG7和miR-122對(duì)瘢痕疙瘩成纖維(keloid fibroblast，KF)細(xì)胞增殖、凋亡的影響及作用機(jī)制，為瘢痕疙瘩治療提供新思路和新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1組織來源 正常皮膚組織和瘢痕疙瘩組織取自我院整形外科手術(shù)患者的全厚皮膚移植術(shù)后的剩余皮片，術(shù)前未經(jīng)任何治療，且經(jīng)臨床和病理診斷為瘢痕疙瘩，所有患者知情同意。正常皮膚組織33例，瘢痕疙瘩組織36例。

1.1.2試劑 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司；二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒、RIPA蛋白裂解液、四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；抗體均購自上海煊翎生物科技有限公司；載體質(zhì)粒購自北京普瑞金科技有限公司。

1.2方法

1.2.1KF細(xì)胞分離培養(yǎng) 無菌條件下除去人瘢痕疙瘩組織表皮及脂肪，用含100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的PBS洗3次，剪碎成組織微粒，DMEM培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2恒溫箱培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，1周后顯微鏡下觀察，待組織微粒周圍有梭形細(xì)胞游出后，吸去組織塊和培養(yǎng)液，換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，HE染色鑒定為KF細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 取對(duì)數(shù)生長期KF細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基同步化12 h，調(diào)整細(xì)胞密度為4×105個(gè)/ml，將si-NC、si-SNHG7、pcDNA3.1、pcDNA3.1-SNHG7、miR-NC、miR-122分別轉(zhuǎn)染至KF細(xì)胞，記為si-NC組(SNHG7陰性對(duì)照組)、si-SNHG7組(SNHG7抑制表達(dá)組)、pcDNA3.1組(SNHG7陽性對(duì)照組)、pcDNA3.1-SNHG7組(SNHG7過表達(dá)組)、miR-NC組(miR-122陽性對(duì)照組)、miR-122組(miR-122過表達(dá)組)；將si-SNHG7分別與anti-miR-NC、anti-miR-122共轉(zhuǎn)染至KF細(xì)胞，記為si-SNHG7+anti-miR-NC組(miR-122陰性對(duì)照組)、si-SNHG7+anti-miR-122組(miR-122抑制劑組)，按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書操作。

1.2.3RT-qPCR檢測SNHG7和miR-122表達(dá) 取各組對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞以5×104個(gè)/ml接種于96孔板，100 μl/孔，培養(yǎng)48 h后按照Trizol說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，SNHG7和miR-122分別以GAPDH和U6為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè) 復(fù)孔。循環(huán)條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；60℃延長5 min。2-ΔΔCt法計(jì)算。SNHG7 F：5′-GTTGGGGTGTTGGGCATTCTTGTT-3′，R：5′-TGGTCAGCCTGGTCACTCTGG-3′；GAPDH F：5′-GTCAGCCGCATCTTCTTTTG-3′，R：5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′；miR-122 F：5′-ACCTCACACTGTTACCACAAA-3′，R：5′-CAGCATAGGTCACGTCCCAG-3′；U6 F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.4Western blot檢測CyclinD1、P21、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) 取各組對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞以5×104個(gè)/ml接種于96孔板，100 μl/孔，培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒定量。將蛋白樣品經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉90 min，加入相應(yīng)的一抗，4℃孵育過夜，PBS洗3次，每次5 min；再加入二抗，室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，每次10 min，暗室中曝光顯影，定影，Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。每個(gè)蛋白樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.5MTT試劑盒檢測細(xì)胞增殖抑制率 取各組對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞以5×104個(gè)/ml接種于96孔板，100 μl/孔，培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)分別加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，37℃孵育4 h；棄培養(yǎng)液，150 μl/孔加入DMSO后振蕩15 min，酶標(biāo)儀于490 nm處檢測各孔吸光度(OD)值。細(xì)胞增殖抑制率(%)=OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組×100%，每組重復(fù)3次取平均值。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后用不含EDTA的胰酶消化，離心收集細(xì)胞，PBS漂洗2次，加結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105個(gè)/ml，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育。流式細(xì)胞儀檢測激發(fā)波長488 nm和發(fā)射波長530 nm處熒光強(qiáng)度，重復(fù)3次。

1.2.7熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測SNHG7對(duì)miR-122的靶向調(diào)控 構(gòu)建SNHG7 3′UTR野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體WT-SNHG7和MUT-SNHG7，LipofectamineTM2000試劑盒將WT-SNHG7、MUT-SNHG7質(zhì)粒分別和miR-NC和miR-122共轉(zhuǎn)染至KF細(xì)胞(細(xì)胞融合度約為60%)，按照說明書操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1SNHG7、miR-122在正常皮膚組織和瘢痕疙瘩組織中的表達(dá) 與正常皮膚組織相比，瘢痕疙瘩組織SNHG7表達(dá)顯著升高，miR-122表達(dá)顯著降低(P<0.05)，見表1。在瘢痕疙瘩組織中SNHG7高表達(dá)，miR-122低表達(dá)，SNHG7與miR-122表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，見圖1。

2.2抑制SNHG7對(duì)KF細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與si-NC組相比，si-SNHG7組KF細(xì)胞中SNHG7表達(dá)顯著降低，CyclinD1、Bcl-2表達(dá)顯著降低，P21、Bax表達(dá)顯著升高，細(xì)胞增殖抑制率顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，見圖2、表2、3。提示抑制SNHG7表達(dá)可抑制KF細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。

2.3SNHG7靶向調(diào)控miR-122 StarBase預(yù)測軟件顯示SNHG7與miR-122存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖3。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-NC組(0.97±0.09)，miR-122組轉(zhuǎn)染SNHG7野生型表達(dá)載體的細(xì)胞KF的熒光素酶活性(0.22±0.02)顯著降低(P<0.05)，而與轉(zhuǎn)染SNHG7突變型表達(dá)載體的KF細(xì)胞的熒光素酶活性(0.99±0.10)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與pcDNA3.1組(1.00±0.10)相比，pcDNA3.1-SNHG7組miR-122表達(dá)顯著降低；與si-NC組(1.02±0.01)相比， si-SNHG7組miR-122表達(dá)(1. 57±0.16)顯著升高(P<0.05)。SNHG7可靶向調(diào)控miR-122表達(dá)。

表1 SNHG7、miR-122在正常皮膚組織和瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)

圖1 SNHG7、miR-122相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analysis between SNHG7 and miR-122

圖2 抑制SNHG7對(duì)細(xì)胞KF增殖、凋亡的影響Fig.2 Effect of inhibition of SNHG7 on proliferation and apoptosis of KF cells

2.4過表達(dá)miR-122對(duì)KF細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與miR-NC組相比，miR-122組KF細(xì)胞中miR-122表達(dá)顯著升高，CyclinD1、Bcl-2表達(dá)顯著降低，P21、Bax表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞增殖抑制率顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，見圖4、表3。過表達(dá)miR-122可抑制KF細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。

圖3 SNHG7與miR-122的靶向關(guān)系Fig.3 Targeting relationship between SNHG7 and miR-122

2.5抑制miR-122表達(dá)可逆轉(zhuǎn)SNHG7對(duì)KF細(xì)胞增殖、凋亡的作用 與si-NC組相比，si-SNHG7組KF細(xì)胞SNHG7表達(dá)顯著降低，miR-122表達(dá)顯著升高，CyclinD1表達(dá)顯著降低，P21表達(dá)顯著升高，細(xì)胞增殖抑制率顯著升高，Bcl-2表達(dá)顯著降低，Bax表達(dá)顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與si-SNHG7+anti-miR-NC組相比，si-SNHG7+anti-miR-122組KF細(xì)胞SNHG7表達(dá)顯著升高，miR-122表達(dá)顯著降低，CyclinD1表達(dá)顯著升高，P21表達(dá)顯著降低，細(xì)胞增殖抑制率顯著降低，Bcl-2表達(dá)顯著升高，Bax表達(dá)顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見圖5、表4。抑制miR-122表達(dá)可逆轉(zhuǎn)SNHG7對(duì)KF細(xì)胞增殖、凋亡的作用。

圖4 過表達(dá)miR-122對(duì)細(xì)胞KF增殖、凋亡的影響Fig.4 Effect of overexpression of miR-122 on proliferation and apoptosis of KF cells

表2 抑制SNHG7對(duì)KF細(xì)胞增殖、凋亡的影響

表3 過表達(dá)miR-122對(duì)細(xì)胞KF增殖、凋亡的影響

圖5 抑制miR-122表達(dá)對(duì)SNHG7對(duì)KF細(xì)胞增殖、凋亡的影響Fig.5 Effect of inhibition of miR-122 expression on SNHG7 for proliferating and apoptosis in KF cells

表4 抑制miR-122表達(dá)cf SNHG7對(duì)KF細(xì)胞增殖的影響

3 討論

瘢痕疙瘩為病理性瘢痕，主要表現(xiàn)為纖維化過度，單獨(dú)手術(shù)切除復(fù)發(fā)率較高，且技術(shù)要求較高，易引起并發(fā)癥，因此，需聯(lián)合藥物治療[11]。闡明瘢痕疙瘩的形成機(jī)制、探尋相應(yīng)的致病基因位點(diǎn)可為瘢痕疙瘩的靶向基因治療提供理論依據(jù)[12]。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA參與皮膚病發(fā)生發(fā)展，與瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[13]。SNHG7在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)結(jié)直腸細(xì)胞系增殖、侵襲和遷移[14]。抑制SNHG7表達(dá)可通過下調(diào)BDNF抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[15]。SNHG7在膀胱癌組織中高表達(dá)，下調(diào)SNHG7可抑制惡性膀胱癌[16]。本研究結(jié)果顯示，在瘢痕疙瘩組織中SNHG7表達(dá)顯著升高，抑制SNHG7表達(dá)KF細(xì)胞中CyclinD1、Bcl-2表達(dá)顯著降低，P21、Bax表達(dá)顯著升高，細(xì)胞增殖抑制率顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著升高，說明抑制SNHG7表達(dá)可抑制KF細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

miRNA參與瘢痕形成過程，調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)/Smads信號(hào)通路、細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解、成纖維細(xì)胞增殖與分化和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-122可促進(jìn)透明腎細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[17]。miR-122在膠質(zhì)瘤患者血漿中呈低表達(dá)，可作為膠質(zhì)瘤診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物[18]。miR-122可靶向作用于Runt相關(guān)基因2(runt-related gene 2，RUNX2)，促進(jìn)線粒體凋亡通路激活及神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡[19]。本研究結(jié)果顯示，瘢痕疙瘩組織中miR-122表達(dá)顯著降低，過表達(dá)miR-122的KF細(xì)胞中CyclinD1、Bcl-2表達(dá)顯著降低，P21、Bax表達(dá)顯著升高，細(xì)胞增殖抑制率顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著升高，提示過表達(dá)miR-122可抑制KF細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，敲低lncRNA HULC可通過上調(diào)miR-122抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，并促進(jìn)其凋亡[20]。lncRNA DRAIC通過靶向下調(diào)miR-122促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[21]。本研究結(jié)果顯示，SNHG7靶向調(diào)控miR-122，抑制miR-122表達(dá)可逆轉(zhuǎn)SNHG7對(duì)KF細(xì)胞增殖和凋亡的促進(jìn)作用，提示SNHG7可能通過調(diào)控miR-122表達(dá)影響KF細(xì)胞增殖和凋亡。

綜上所述，抑制SNHG7表達(dá)可抑制人KF細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與靶向調(diào)控miR-122有關(guān)，為瘢痕疙瘩的治療提供新思路和新靶點(diǎn)。