miR-124-3p靶向WISP1對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的大鼠腦動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響①

張海萍 袁 梅 彭 慧

(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，衡陽(yáng) 421000)

血管平滑肌細(xì)胞具有維持血管正常生理功能的作用，廣泛參與一系列腦血管疾病的進(jìn)展，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1]。因此深入研究血管平滑肌細(xì)胞生物學(xué)行為及其調(diào)控機(jī)制為心腦血管疾病的防治提供新方向和新靶點(diǎn)意義重大。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與血管形成、血管衰老、心肌肥大、動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病等心血管疾病相關(guān)，在心血管疾病治療中起重要作用，可作為該類疾病診斷的生物標(biāo)記物與治療靶點(diǎn)[2]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-124可抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖[3]；miR-124還可減弱人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖和表型轉(zhuǎn)換[4]。同型半胱氨酸誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化中miR-124表達(dá)水平明顯降低[5]。研究發(fā)現(xiàn)WNT1誘導(dǎo)信號(hào)通路蛋白1(WNT1-induced signaling pathway protein 1，WISP1)具有調(diào)節(jié)增殖、遷移的功能，在血管生成、炎癥、創(chuàng)傷修復(fù)和腫瘤發(fā)生過(guò)程中起重要作用[6]。過(guò)表達(dá)WISP1能夠促進(jìn)人胸主動(dòng)脈血管平滑肌的增殖及遷移[7]。WISP1可降低過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞凋亡[8]。然而miR-124-3p對(duì)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)誘導(dǎo)的大鼠腦動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響及其機(jī)制尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)旨在研究miR-124-3p對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的大鼠腦動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲影響及其機(jī)制是否與WISP1有關(guān),為血管平滑肌細(xì)胞引起的相關(guān)心血管疾病的防治提供新思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；TNF-α購(gòu)自上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；二甲基亞砜(DMSO)、RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒、PBS緩沖液購(gòu)自Sigma公司；抗體購(gòu)自上海煊翎生物科技有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司；Transwell小室、Matrigel膠購(gòu)于美國(guó)BD公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京Solarbio公司。miR-NC、miR-124-3p、anti-miR-NC、anti-miR-124-3p、si-NC、si-WISP1、pcDNA、pcDNA-WISP1、WT-WISP1、MUT-WISP1質(zhì)粒購(gòu)自北京源生思創(chuàng)生物科技有限公司。Thermo FC酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；FACS caliber流式細(xì)胞儀、PowerPac蛋白電泳儀及Gel Doc XR+凝膠顯示系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BD公司;熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2方法

1.2.1分離培養(yǎng)大鼠腦動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞 取購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心雄性SD大鼠2～3只，將大鼠麻醉后處死，迅速取出整腦，在解剖顯微鏡下分離大腦基底動(dòng)脈，剪碎后置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入含20%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待組織塊與瓶底黏附后將培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn)平放，繼續(xù)培養(yǎng)3 d可見細(xì)胞爬出，換液后繼續(xù)培養(yǎng)10 d,組織塊周圍細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時(shí)，進(jìn)行傳代，取培養(yǎng)3代后細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞處理與分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)12 h后加入100 ng/ml的TNF-α作為TNF-α組，正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組(Con)；將miR-NC、miR-124-3p、anti-miR-NC、anti-miR-124-3p轉(zhuǎn)染至大鼠腦基底動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞中，分別記為miR-NC組、miR-124-3p組、anti-miR-NC組、anti-miR-124-3p組；將miR-NC、miR-124-3p、si-NC、si-WISP1轉(zhuǎn)染至大鼠腦基底動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞后再用100 ng/ml的TNF-α處理，記為TNF-α+miR-NC組、TNF-α+miR-124-3p組、TNF-α+si-NC組、TNF-α+si-WISP1組；將miR-124-3p分別與pcDNA、pcDNA-WISP1共轉(zhuǎn)染至大鼠腦基底動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞后再用100 ng/ml 的TNF-α處理，記為TNF-α+miR-124-3p+pcDNA組、TNF-α+miR-124-3p+pcDNA-WISP1組。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-124-3p和WISP1 mRNA表達(dá)水平 細(xì)胞培養(yǎng)48 h后提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)條件為95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；60℃延長(zhǎng)5 min。相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算。miR-124-3p和WISP1分別以U6和β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，miR-124-3p上游引物序列：5′-GCTTAAGGCACGC-GGT-3′，下游引物序列：5′-GTGCAGGGTCGGAGGT-3′；U6上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。WISP1上游引物序列：5′-AGGTATGGCAGAGGTGCAAG-3′，下游引物序列：5′-GTGTGTGTAGGCAGGGAGTG-3′；β-actin上游引物序列：5′-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3′，下游引物序列：5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3′。

1.2.4Western blot檢測(cè)WISP1、CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平 細(xì)胞培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒定量后將蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)至PVDF，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌；加入二抗(1∶2 000)室溫孵育90 min，TBST洗滌，用ECL發(fā)光液顯影，成像后用Quantity One凝膠分析軟件測(cè)定各組蛋白條帶的灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。每個(gè)蛋白樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.5MTT檢測(cè)細(xì)胞活性 各組細(xì)胞培養(yǎng)至48 h時(shí)加入20 μl MTT溶液，37℃孵育4 h；棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO后振蕩反應(yīng)10 min，在490 nm 波長(zhǎng)條件下用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度(OD)值。細(xì)胞活性(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.6Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×105個(gè)/ml。①細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：取200 μl細(xì)胞懸液接種于Transwell小室上室中，下室加入500 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后取出小室，吸去培養(yǎng)液后用棉簽輕輕擦去上層細(xì)胞，PBS洗滌，4 %多聚甲醛固定30 min，再用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡拍照并計(jì)數(shù)。②細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：以1∶6比例加入DMEM培養(yǎng)液稀釋Matrigel后，包被Transwell小室的上室，室溫下干燥凝固后，按照細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)步驟操作。最后顯微鏡下觀察結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)即為侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.7熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-124-3p對(duì)WISP1的靶向調(diào)控 構(gòu)建含有miR-124-3p結(jié)合位點(diǎn)的WISP1-3 UTR野生型及突變型報(bào)告基因載體，將miR-NC、miR-124-3p與野生型及突變型報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染至大鼠腦基底動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞中。按照說(shuō)明書檢測(cè)熒光素酶活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1miR-124-3p和WISP1在TNF-α誘導(dǎo)的大鼠腦動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá) 與對(duì)照組相比，TNF-α組miR-124-3p表達(dá)水平顯著降低，WISP1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見表1。

2.2miR-124-3p過(guò)表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的大鼠腦動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組相比，TNF-α組miR-124-3p表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞活性顯著升高，CyclinD1表達(dá)水平顯著升高，p21表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與TNF-α+miR-NC組相比，TNF-α+miR-124-3p組miR-124-3p表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞活性顯著降低，CyclinD1表達(dá)水平顯著降低，p21表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見圖1、表2。

2.3miR-124-3p過(guò)表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的大鼠腦動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞遷移侵襲的影響 與對(duì)照組相比，TNF-α組細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)顯著升高，MMP-2、MMP-9表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與TNF-α+miR-NC組相比，TNF-α+miR-124-3p組細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)顯著降低，MMP-2、MMP-9表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見圖2、表3。

表1 miR-124-3p和WISP1在TNF-α誘導(dǎo)的大鼠腦動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)

圖1 增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.1 Expressions of proliferation-related proteins

圖2 遷移侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.2 Expressions of migration-invasive related proteins

表2 miR-124-3p過(guò)表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的大鼠腦動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響

表3 miR-124-3p過(guò)表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的大鼠腦動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞遷移侵襲的影響

2.4干擾WISP1表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的大鼠腦動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響 與對(duì)照組相比，TNF-α組WISP1表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞活性顯著升高，遷移、侵襲數(shù)顯著升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平顯著升高，p21表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與TNF-α+si-NC組相比，TNF-α+si-WISP1組WISP1表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞活性顯著降低，細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)顯著降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平顯著降低，p21表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見圖3、表4。

2.5miR-124-3p靶向調(diào)控WISP1的表達(dá) Starbase預(yù)測(cè)WISP1與miR-124-3p存在結(jié)合位點(diǎn)(圖4A)。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于miR-NC組，miR-124-3p組轉(zhuǎn)染野生型WISP1(WT-WISP1)表達(dá)載體的大鼠腦動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05，表5)；而轉(zhuǎn)染突變型WISP1(MUT-WISP1)表達(dá)載體的大鼠腦動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的熒光素酶活性差異不顯著。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，相較于miR-NC組，miR-124-3p組WISP1表達(dá)水平顯著降低；相較于anti-miR-NC組，anti-miR-124-3p組WISP1表達(dá)水平顯著升高(P<0.05，圖4B、表6)。可見，miR-124-3p可靶向調(diào)控WISP1的表達(dá)。

2.6WISP1過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-124-3p過(guò)表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的大鼠腦動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移侵襲的作用 與TNF-α+miR-124-3p+pcDNA組相比，TNF-α+miR-124-3p+pcDNA-WISP1組大鼠腦動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞中WISP1表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞活性顯著升高，遷移、侵襲數(shù)顯著升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平顯著升高，p21表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見圖5、表7。

圖3 WISP1和增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.3 Expressions of WISP1 and proliferation,migration and invasion-associated proteins

圖4 miR-124-3p靶向調(diào)控WISP1的表達(dá)Fig.4 miR-124-3p targeted regulation of WISP1 expressionNote:A.3′UTR sequence of WISP1 contains a nucleotide sequence complementary to miR-124-3p;B.WISP1 protein expression.

表4 干擾WISP1表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的大鼠腦動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表6 miR-124-3p調(diào)控WISP1蛋白的表達(dá)

表7 WISP1過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-124-3p過(guò)表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的大鼠腦動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移侵襲的作用

圖5 WISP1和增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.5 Expressions of WISP1 and proliferation,migration and invasion-associated proteins

3 討論

血管平滑肌細(xì)胞是血管壁的主要成分，其異常增殖和遷移是動(dòng)脈粥樣硬化、腦梗死、血管形成術(shù)后再狹窄等心腦血管疾病病變的基礎(chǔ)[9]。研究顯示miRNA參與了血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移[10]。miR-124可消除氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[11]。miR-124-3p還可抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的膠原蛋白合成[12]。miR-124-3p能抑制血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)-BB誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-124-3p后，TNF-α誘導(dǎo)的大鼠腦動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞中細(xì)胞活性顯著降低，遷移、侵襲數(shù)顯著降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平顯著降低，p21表達(dá)水平顯著升高，說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-124-3p可抑制TNF-α誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞異常增殖、遷移和侵襲，表明miR-124-3p可能與血管相關(guān)疾病有關(guān)。

有研究報(bào)道WISP1對(duì)假性動(dòng)脈瘤APOE-/-敲除小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化和脆弱性具有保護(hù)作用[14]。沉默WISP1減少小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的遷移[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TNF-α處理的大鼠腦動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞中WISP1表達(dá)水平顯著升高，干擾WISP1表達(dá)，細(xì)胞活性顯著降低，遷移、侵襲數(shù)顯著降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平顯著降低，p21表達(dá)水平顯著升高，說(shuō)明干擾WISP1表達(dá)可抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。且本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)miR-124-3p靶向調(diào)控WISP1，WISP1過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-124-3p過(guò)表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的大鼠腦動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用。

綜上所述，miR-124-3p可抑制TNF-α誘導(dǎo)的大鼠腦動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制可能與下調(diào)WISP1有關(guān)，可為相關(guān)心血管疾病的防治提供新靶點(diǎn)和理論依據(jù)。