基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法高效檢測(cè)模擬眼內(nèi)液中銅綠假單胞菌的研究△

孫楊 榮先芳 盧奕 季櫻紅

(復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科 國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)近視眼重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院近視眼重點(diǎn)實(shí)驗(yàn) 上海市視覺(jué)損害與重建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200031)

年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age-related cataract, ARC)是全球范圍內(nèi)首位致盲眼病，在各種原因?qū)е碌囊暳适Р±姓家话胫郲1]。通過(guò)大型流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在我國(guó)≥60歲人群，白內(nèi)障是雙眼(66.8%)和單眼(61.2%)視力損傷的主要原因[2]。白內(nèi)障迄今尚缺乏有效的治療藥物，手術(shù)是目前唯一的有效治療方式。感染性眼內(nèi)炎是白內(nèi)障手術(shù)的嚴(yán)重并發(fā)癥。目前我國(guó)大型和中小型眼科機(jī)構(gòu)白內(nèi)障術(shù)后感染性眼內(nèi)炎的急性發(fā)病率分別為0.033%和0.11%[3]。常見致病菌包括凝固酶陰性表面葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌屬及革蘭陰性桿菌如銅綠假單胞菌等[4]。銅綠假單胞菌是醫(yī)院感染最常見的病原菌之一[5]，是白內(nèi)障術(shù)后感染主要的革蘭陰性致病菌,毒力危害強(qiáng), 導(dǎo)致暴發(fā)性感染；感染發(fā)生時(shí)極難控制，易造成視力喪失,甚至破壞整個(gè)眼球。眼內(nèi)銅綠假單胞菌早期的快速診斷對(duì)治療白內(nèi)障術(shù)后感染的臨床意義重大。傳統(tǒng)的臨床細(xì)菌培養(yǎng)法，診斷周期長(zhǎng)，1～7 d，對(duì)樣本保存條件高，且陽(yáng)性率不高。而聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)時(shí)間較長(zhǎng)，擴(kuò)增產(chǎn)物需要電泳證實(shí)，專業(yè)設(shè)備昂貴，且易污染、假陽(yáng)性率高，使其應(yīng)用受到限制。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop mediated isothermal amplification， LAMP)技術(shù)只需要一種恒定溫度，擴(kuò)增時(shí)間短，儀器簡(jiǎn)單，是一種快速、準(zhǔn)確、低成本的診斷方法。

LAMP技術(shù)檢測(cè)銅綠假單胞菌，目前主要在全身如呼吸道等疾病中應(yīng)用，在眼部的應(yīng)用開展極少。本文將應(yīng)用該技術(shù)檢測(cè)于手術(shù)后引起眼內(nèi)炎的銅綠假單胞菌，建立眼內(nèi)液中銅綠假單胞菌的快速檢測(cè)體系。

1 材料與方法

1.1 材料 本實(shí)驗(yàn)所用的菌株見表1。6種菌株來(lái)自于中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心和ATCC，其中表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌、肺炎鏈球菌和蠟樣芽胞桿菌用于銅綠假單胞菌引物的特異性篩選。

表1 實(shí)驗(yàn)所用菌株

1.1.1 試劑 dNTPs(美國(guó)Thermo Fisher公司)；10×ThermoPol Reaction Buffer，Bst DNA 聚合酶大片段(美國(guó)NEB公司)；SYBR GREEN I(美國(guó)Sigma公司)；硫酸鎂(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備 恒溫?cái)U(kuò)增儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)；離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)；UVP Gel Doc-IT凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司)；Nanodrop 超微量紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1 眼內(nèi)液的模擬 采用眼內(nèi)平衡鹽溶液(balanced salt solution, BSS)(美國(guó)Alcon公司) 0.1～0.2 mL模擬眼內(nèi)液。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與篩選 LAMP引物包含F(xiàn)3、B3、FIP、BIP、LF和LB 6條引物。引物設(shè)計(jì)主要考慮因素包括：引物的Tm值、長(zhǎng)度、引物互補(bǔ)片段之間的距離[6]，引物設(shè)計(jì)主要通過(guò)在線網(wǎng)站PrimerExplorerV5設(shè)計(jì)(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)。我們首先在NCBI上選取銅綠假單胞菌特征性片段，選其中g(shù)bca基因中的一段設(shè)計(jì)LAMP 特異性引物，設(shè)計(jì)的5組特異性引物分別針對(duì)待擴(kuò)增DNA 的5 個(gè)不同對(duì)應(yīng)區(qū)域，其中含1 條環(huán)狀引物L(fēng)F，2 條外引物F3、B3 以及內(nèi)引物FIP、BIP。每組引物混合成Mix(F3 5 μmol/L, B3 5 μmol/L，F(xiàn)IP 40 μmol/L，BIP 40 μmol/L,LF 20 μmol/L)，在ABI 7500儀器上以程序63 ℃，1 min，45個(gè)循環(huán)按照NEB標(biāo)準(zhǔn)LAMP擴(kuò)增體系(10×ThermoPol reaction buffer 2.5 μL， 10 mmol/L dNTPs 3.5 μL，引物Mix 1 μL，Bst DNA聚合酶大片段 8U，樣本1 μL，水補(bǔ)齊至25 μL)進(jìn)行引物陰性、陽(yáng)性篩選和BSS病原微生物特異性篩選，最后篩選出一組引物，見表2。

表2 銅綠假單胞菌引物表

1.2.3 細(xì)菌核酸提取 將銅綠假單胞菌、表皮葡萄菌、金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌、肺炎鏈球菌和蠟樣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種到對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基中，待生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期后，收集菌體，通過(guò)QiAmp DNA Mini Kit提取菌株基因組DNA,用Nanodrop 分別進(jìn)行基因組DNA濃度定量。

1.2.4 實(shí)時(shí)LAMP體系建立與優(yōu)化 25 μL LAMP初始體系參考NEB公司建議體系，將上步提取的標(biāo)準(zhǔn)銅綠假單胞菌基因組DNA首先稀釋到1 ng/μL 進(jìn)行初始體系優(yōu)化，初始反應(yīng)體系里加入0.1 mol/L鎂離子0、1、2、3 μL，優(yōu)化反應(yīng)曲線，確定完最佳反應(yīng)曲線。

1.2.5 LAMP的靈敏度檢測(cè) 將1.2.3步中提取的基因組DNA倍比稀釋到1 ng/μL，100 pg/μL，10 pg/μL，1 pg/μL，100 fg/μL，10 fg/μL，1 fg/μL，100 ag/μL，10 ag/μL，每個(gè)濃度梯度下的核酸定量結(jié)果重復(fù)6次以上，用1.2.4優(yōu)化的體系進(jìn)行反應(yīng)，讀取最終檢測(cè)熒光曲線。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)驗(yàn)證 用篩選好的LAMP引物的F3和B3進(jìn)行實(shí)時(shí)qPCR，使用ThermoFisher 公司SuperScript IV One-Step RT-PCR System進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的50 μL反應(yīng)，檢測(cè)核酸按照1.2.5的稀釋量進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 5 min，再按(94 ℃ 15 s，54 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán))，讀取最終熒光曲線。

1.2.7 BSS中銅綠假單胞菌靈敏度檢測(cè) 取培養(yǎng)好的菌懸液，倍比稀釋后加入BSS中，稀釋成2.1×107、2.1×106、2.1×105、2.1×104、2.1×103、2.1×102、2.1 CFU/mL，用無(wú)水乙醇、氨水和石油醚混合液萃取樣品，取沉淀物用1.2.3步驟進(jìn)行菌株基因組DNA提取。

2 結(jié)果

2.1 引物的篩選 如圖1所示，從5組引物中最終篩選出第3組引物，其陰性擴(kuò)增不出峰，陽(yáng)性反應(yīng)出峰時(shí)間在30 min之前。將其和常見5種眼內(nèi)炎微生物進(jìn)行交叉擴(kuò)增，沒(méi)有出峰，最終確定該組引物可用于后續(xù)的靈敏度檢測(cè)和眼內(nèi)液中銅綠假單胞菌檢測(cè)。

圖1 銅綠假單胞菌的擴(kuò)增引物篩選。A、B. 分別為銅綠假單胞菌擴(kuò)增引物的陰性和陽(yáng)性篩選；C. 為經(jīng)A圖和B圖篩選好的第3組引物的特異性驗(yàn)證。

2.2 實(shí)時(shí)LAMP體系 鎂離子的濃度和Bst酶的活性有著很高的相關(guān)性，最適合的鎂離子濃度是高效反應(yīng)的關(guān)鍵。在具體的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，首先按照標(biāo)準(zhǔn)體系對(duì)額外的鎂離子濃度為基準(zhǔn)進(jìn)行優(yōu)化，分別在對(duì)應(yīng)核酸的陰性擴(kuò)增反應(yīng)和陽(yáng)性擴(kuò)增反應(yīng)中加入0.1 mol/L硫酸鎂0、1、2、3 μL，比較其差別，結(jié)果見圖2。由圖見額外加入1 μL 0.1 mol/L鎂離子的量有利于LAMP反應(yīng)的進(jìn)行，當(dāng)額外加入鎂離子的量超過(guò)1 μL后，陰性對(duì)照組的出峰時(shí)間也會(huì)提前，不利于反應(yīng)的判斷，所以1 μL的0.1 mol/L鎂離子是最適加入量。

圖2 銅綠假單胞菌LAMP體系優(yōu)化 A、B. 鎂離子分別在陰性反應(yīng)和陽(yáng)性反應(yīng)中的優(yōu)化。

2.3 LAMP檢測(cè)銅綠假單胞菌的靈敏度 將銅綠假單胞菌的基因組DNA以優(yōu)化擴(kuò)增條件時(shí)的核酸濃度向下稀釋108倍，結(jié)果見圖3。從圖中可以看出，優(yōu)化后的LAMP體系(10×ThermoPol Reaction Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 3.5 μL, 引物Mix 1 μL，0.1 mol/L MgSO41 μL，Bst DNA聚合酶大片段 8U，樣本1 μL，水補(bǔ)齊至25 μL)可以檢測(cè)的純基因組DNA限度在100 fg/μL。

圖3 銅綠假單胞菌的LAMP檢測(cè)靈敏度

2.4 實(shí)時(shí)qPCR對(duì)LAMP檢測(cè)銅綠假單胞的驗(yàn)證 對(duì)銅綠假單胞菌核酸稀釋實(shí)驗(yàn)，可以發(fā)現(xiàn)LAMP方法在銅綠假單胞檢測(cè)體系的檢測(cè)限大約是100 fg/μL。為了驗(yàn)證該擴(kuò)增方法的準(zhǔn)確性，我們選擇通用的實(shí)時(shí)qPCR法對(duì)上述9個(gè)濃度梯度的核酸進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4，實(shí)時(shí)qPCR法可以檢測(cè)1 fg/μL。

圖4 實(shí)時(shí)qPCR靈敏度

2.5 灌注液中銅綠假單胞菌的靈敏度檢測(cè) 銅綠假單胞菌總共稀釋成2.1×107、2.1×106、2.1×105、2.1×104、2.1×103、2.1×102、2.1 CFU/mL 7個(gè)濃度梯度，這些濃度梯度菌落稀釋液和BSS混合，萃取，提取完基因組核酸后，進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)，結(jié)果如圖5，可以看出該體系的檢測(cè)限可以達(dá)到2.1×102CFU/mL。

圖5 BSS中銅綠假單胞菌靈敏度檢測(cè)

3 討論

正常人的眼周組織如結(jié)膜囊、眼瞼、睫毛等處以及空氣中存在大部分細(xì)菌，尤其是表皮葡萄球菌。這些正常菌群在白內(nèi)障手術(shù)時(shí)，通過(guò)手術(shù)器械、灌注液及人工晶狀體等進(jìn)入眼內(nèi), 在合適的條件下生長(zhǎng), 導(dǎo)致眼內(nèi)感染。因此白內(nèi)障術(shù)后眼內(nèi)炎以表皮葡萄球菌最為常見，屬弱致病菌。本課題組曾將LAMP和微流控芯片技術(shù)(On Chip)結(jié)合應(yīng)用于超聲乳化白內(nèi)障術(shù)畢時(shí)前房水的表皮葡萄球菌檢測(cè)，以傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法做對(duì)照，具有很高的特異度與敏感度[7]。本研究主要采用LAMP管內(nèi)技術(shù)(In tube)，設(shè)計(jì)了針對(duì)銅綠假單胞菌的LAMP引物，和qPCR對(duì)比，以摸索銅綠假單胞菌的檢測(cè)靈敏度。

銅綠假單胞菌并不屬于眼部的正常菌群，是呈長(zhǎng)棒形的革蘭陰性桿菌，與水聯(lián)系緊密。醫(yī)院內(nèi)長(zhǎng)期潮濕的地方及濕的物品是其駐扎的場(chǎng)所，從而導(dǎo)致醫(yī)源性感染。白內(nèi)障手術(shù)相關(guān)的銅綠假單胞菌往往來(lái)自外源性污染，包括被污染的灌注液、囊膜染色劑、黏彈劑、超聲乳化管道等[8-12]。該菌能產(chǎn)生多種與毒力有關(guān)的細(xì)胞外酶以及毒素，包括彈性蛋白酶、堿性蛋白酶、磷脂酶、卵磷脂酶、細(xì)胞毒素、外毒素A、外酶等。其中彈性蛋白酶和堿性蛋白酶可破壞包括纖維蛋白和彈性蛋白組成的角膜或其他組織。而磷脂酶和卵磷脂酶協(xié)同作用，分解脂質(zhì)和卵磷脂，從而破壞整個(gè)眼部組織。感染一旦發(fā)生，極難控制, 易造成視力喪失,甚至破壞整個(gè)眼球，治療需要爭(zhēng)分奪秒。學(xué)者[13]報(bào)道，1997～2007年收治的71例患者共72眼感染銅綠假單胞菌，最終58眼無(wú)光感，占8成。2005年12月11日，安徽省宿州市立醫(yī)院10例白內(nèi)障患者在術(shù)后發(fā)生感染性眼內(nèi)炎，最終9例被摘除眼球，經(jīng)我院病原學(xué)檢測(cè)證實(shí)為銅綠假單胞菌(綠膿桿菌)感染[14]。

鑒定銅綠假單胞菌的傳統(tǒng)方法有顯微鏡觀察、生化學(xué)鑒定和細(xì)菌分離培養(yǎng)等，這些技術(shù)不僅需要昂貴設(shè)備和經(jīng)驗(yàn)豐富人員，而且過(guò)程復(fù)雜、操作耗時(shí)、陽(yáng)性率不高。隨著基因技術(shù)發(fā)展，PCR已經(jīng)成功用于檢測(cè)銅綠假單胞菌[15]。雖然PCR 在特異度和敏感度上有較大的提高，但是無(wú)論普通PCR 還是qPCR都需要通過(guò)繁瑣的變溫程序進(jìn)行檢測(cè), 且普通PCR 后續(xù)需要電泳才能觀察結(jié)果，目前qPCR技術(shù)相對(duì)更加成熟。

LAMP是Notomi等[16]于2000年公布的技術(shù)，其核心是利用4～6條引物，形成具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的莖-環(huán)元件，然后利用莖-環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)對(duì)模板的指數(shù)擴(kuò)增。LAMP結(jié)果可通過(guò)觀察擴(kuò)增管濁度來(lái)進(jìn)行判斷[17]，也可以引入非選擇性核酸染料如SYBR Green I (SGI)來(lái)進(jìn)行跟蹤核酸實(shí)時(shí)擴(kuò)增檢測(cè)的濃度[18]。

LAMP和qPCR、高通量測(cè)序(NGS)的異同點(diǎn)如下。①成本費(fèi)用：包括儀器成本與試劑成本。儀器成本：NGS>>PCR>LAMP，LAMP只要1個(gè)溫度(65 ℃左右)，相對(duì)于qPCR的3個(gè)溫度循環(huán)(94 ℃變性，55 ℃退火，72 ℃延伸)，LAMP擴(kuò)增儀器的溫控更容易實(shí)現(xiàn)，儀器更簡(jiǎn)單、便宜，且易攜帶，適合于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。試劑成本：NGS建庫(kù)檢測(cè)成本>PCR≈LAMP，和qPCR相比，LAMP的引物需要4～6個(gè)，且一般較長(zhǎng)，引物設(shè)計(jì)難度高。②擴(kuò)增時(shí)間：NGS>PCR>LAMP，LAMP擴(kuò)增不需要反復(fù)升溫、降溫過(guò)程，快于qPCR的擴(kuò)增速度。LAMP一般可在30～60 min擴(kuò)增109～1010倍，而qPCR的擴(kuò)增速度往往取決于擴(kuò)增儀器加熱和冷卻的速率，需要2～3 h。③特異度：LAMP技術(shù)一般需要4～6個(gè)引物，而qPCR只用2個(gè)引物，理論上LAMP的核酸擴(kuò)增特異度更強(qiáng)。④靈敏度：PCR的檢測(cè)限和LAMP檢測(cè)限相仿，具體到不同菌株是不一樣的，而NGS需要的起始量一般較高。⑤擴(kuò)增環(huán)境：和qPCR相比，LAMP受臨床標(biāo)本中成分的影響更小, DNA的純化步驟可以省略[19]。LAMP方法比qPCR方法更快速、簡(jiǎn)便，目前成為快速檢測(cè)/現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中非常重要的檢測(cè)方法，廣泛用于病原微生物的快速檢測(cè)和初步篩選[20]。NGS雖然具有檢測(cè)準(zhǔn)確、覆蓋全面等優(yōu)勢(shì)，但是對(duì)人員專業(yè)要求高，檢測(cè)成本較高，臨床應(yīng)用在微生物較少，目前更多用于科研領(lǐng)域。

LAMP引物篩選常易出現(xiàn)假陰性和交叉性，這些都會(huì)限制LAMP體系的適應(yīng)性，甚至導(dǎo)致檢測(cè)體系的失敗[21]。在本研究中，我們首先進(jìn)行了引物的陰性、陽(yáng)性和交叉性實(shí)驗(yàn)，成功篩選出一組引物，為后續(xù)的體系優(yōu)化和建立提供一個(gè)出發(fā)點(diǎn)和基礎(chǔ)。在LAMP體系的優(yōu)化中，鎂離子是一種很重要的金屬離子，它可以調(diào)節(jié)引物與模板的結(jié)合強(qiáng)度，直接影響聚合酶的作用[22]。本反應(yīng)體系在NEB環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增體系基礎(chǔ)上進(jìn)行鎂離子的調(diào)試，得出最優(yōu)化緩沖液，優(yōu)化后的反應(yīng)體系可以提高檢測(cè)的靈敏度。LAMP現(xiàn)在已經(jīng)有成熟的商業(yè)化試劑，但是其顯色方法有很多選擇，比如SGI、HNB、Calcein、MB等。不同的顯色劑，反應(yīng)條件有所不同。本研究是在SGI顯色劑情況下，篩選出特殊的反應(yīng)成分和引物，在本方案達(dá)到反應(yīng)效率最高，自行配置試劑和篩選引物，引物特異度高，且可根據(jù)需要進(jìn)行靈活條件改變，應(yīng)用范圍更廣。本研究建立了一個(gè)基于LAMP的銅綠假單胞菌檢測(cè)體系，檢測(cè)靈敏度達(dá)到100 fg/μL。將銅綠假單胞菌稀釋到灌注液中進(jìn)行倍比稀釋，發(fā)現(xiàn)可以檢出2.1×102CFU/mL，1 h內(nèi)就可以得出結(jié)果，是qPCR所需時(shí)間的1/2甚至1/3，尤其適用于快速發(fā)展的高毒力細(xì)菌的高效檢測(cè)，并適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

銅綠假單胞菌導(dǎo)致的眼內(nèi)炎雖然破壞嚴(yán)重，但發(fā)病率較低。BSS和房水極其類似，因此本實(shí)驗(yàn)采用BSS模擬眼內(nèi)的房水和玻璃體液，加入銅綠假單胞菌進(jìn)行條件和方法摸索。另外，我們首先在NCBI上選取銅綠假單胞菌特征性片段，利用gbca基因作為L(zhǎng)AMP的目的基因。該基因存在于所有的銅綠假單胞菌中。對(duì)gbca基因設(shè)計(jì)5組LAMP 特異性引物，分別針對(duì)待擴(kuò)增DNA 的5 個(gè)不同對(duì)應(yīng)區(qū)域，其中第3組引物能特異性地鑒別銅綠假單胞菌，區(qū)分于可能引起眼內(nèi)炎的其他5種細(xì)菌，可用于銅綠假單胞菌在眼內(nèi)液中的檢測(cè)。

綜上所述，本研究應(yīng)用LAMP檢測(cè)眼科手術(shù)后引起感染性眼內(nèi)炎的銅綠假單胞菌，在實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了檢測(cè)的特異度和靈敏度，優(yōu)化了擴(kuò)增體系，并且和實(shí)時(shí)qPCR來(lái)進(jìn)行對(duì)照；同時(shí)，將銅綠假單胞菌和0.1～0.2 mL BSS制成混合物，檢測(cè)灌注液中銅綠假單胞菌的靈敏度，設(shè)計(jì)了檢驗(yàn)科可以使用的檢測(cè)方法，建立了眼內(nèi)液中銅綠假單胞菌高效、快速的檢測(cè)方法，具有廣泛的臨床意義。