針刺調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子改善大鼠腦梗死急性期腦血流的USPIO-DSC MRI研究

楊爍慧，吳瑜，詹松華，楊辰瑤，孔營楠，張成，陸方*

中風(fēng)是世界范圍內(nèi)第五大常見的成人致死的病因，也是成人永久性致殘最常見的原因之一。由腦血管斑塊堵塞或血栓栓塞引起的缺血性中風(fēng)約占所有中風(fēng)的87%[1]。越來越多的證據(jù)表明，缺血性中風(fēng)后炎性反應(yīng)對于中風(fēng)的進展和預(yù)后有重要影響[2]。已有研究證明針刺可以減輕缺血性中風(fēng)后炎性反應(yīng)[3]以及改善腦梗死區(qū)域微循環(huán)灌注[4-7]。超微超順磁氧化鐵微粒(ultrasmall superparamagnetic particles of iron oxides，USPIO)是一種血池性對比劑，其血漿半衰期長，磁敏感效應(yīng)強，高劑量耐受性好，較釓噴酸葡胺鹽(GDDTPA)更能準(zhǔn)確反映梗死區(qū)域腦血流的灌注情況[8]，因此，筆者利用USPIO動態(tài)磁敏感增強(USPIO-dynamic susceptibility contrast，USPIO-DSC) MRI灌注掃描來探討針刺通過調(diào)節(jié)大鼠腦梗死急性期血清炎性細(xì)胞因子的水平以達(dá)到改善腦梗死區(qū)域血流灌注的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)計

本實驗通過本院倫理和動物保護委員會備案和批準(zhǔn)(SZY201712006)。清潔級健康成年雄性SD大鼠26只，體重規(guī)格為230～250 g (購于北京維通利華實驗動物公司，在上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng))。將大鼠隨機分為三組，A組假手術(shù)組6只、B組無電針梗死組10只、C組電針梗死組10只，每組再根據(jù)時間節(jié)點24 h、48 h分為二個亞組，C組24 h和48 h亞組各有一只大鼠因造模失敗而剔除出組，最終入組A組每個亞組各3只大鼠，B組每個亞組各5只大鼠，C組每個亞組4只大鼠。

1.2 模型制作

SD大鼠采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量為0.35 ml/100 g。大鼠永久性大腦中動脈栓塞模型(permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO)的建立參照Longa線栓法[9]并且加以改良，其中A組線栓插入深度距離頸總動脈分叉約0.5 cm，B組和C組線栓插入深度距離頸總動脈分叉約1.6～2.0 cm，B組和C組大鼠造模麻醉蘇醒后有相應(yīng)轉(zhuǎn)圈、側(cè)倒或偏癱視為造模成功。

1.3 針刺方法

C組大鼠穴位定位按照李忠仁等[10]制定的實驗動物腧穴圖譜，選取百會穴、右側(cè)足三里穴和水溝穴，以醫(yī)用華佗牌不銹鋼28號1.5寸(1寸=3.33 cm)毫針快速刺入穴位，連接電針治療儀(G6805-2，上海醫(yī)療器械高技術(shù)公司)。刺激參數(shù)為：疏密波4 Hz/20 Hz，脈沖寬度0.5 ms[11]。輸出電壓從1 V開始，每10 min增加1 V，最大為3 V，輸出電流0.5 mA。造模完成待大鼠完全蘇醒后執(zhí)行第一次針刺，其后每間隔24 h電針一次，每次電針通電30 min，每日電針一次。A組大鼠在造模后不加任何處理，B組大鼠在C組大鼠電針的同時對其進行捆綁固定，不做針刺。

1.4 儀器和方法

所有檢查均在1.5 T磁共振系統(tǒng)(UMR560；上海聯(lián)影醫(yī)療技術(shù)有限公司，上海，中國)上完成，采用12通道相控陣腕關(guān)節(jié)線圈。MR掃描序列及參數(shù)：冠狀位T1WI快速自旋回波序列(TR 450 ms，TE 12 ms，層厚2 mm，間距0.2 mm，F(xiàn)OV 80 mm×80 mm，矩陣100×192，NEX為4)、T2WI快速自旋回波序列(TR 3000 ms，TE 154 ms，層厚2 mm，間距0.2 mm，F(xiàn)OV 80 mm×80 mm，矩陣100×192，NEX為4)、DWI單次激發(fā)平面回波序列(TR 2500 ms，TE 94 ms，層厚3 mm，間距0.3 mm，F(xiàn)OV 100 mm×100 mm，矩陣100×96，NEX為5，b=0和1000 s/mm2)、T2*WI動態(tài)磁敏感加權(quán)序列(TR 1400 ms，TE 36 ms，層厚2 mm，間距0.2 mm，F(xiàn)OV 100 mm×100 mm，矩陣100×96，NEX為1)。T2*WI 動態(tài)磁敏感對比增強(susceptibilityweighted contrast-enhanced，DSC) MRI共掃描60個動態(tài)，前5個動態(tài)作為基線掃描，第6個動態(tài)開始，從大鼠尾靜脈以0.1 mL/s團注6 mg Fe/kg[12]USPIO溶液(上海交通大學(xué)Med-X研究所提供)。

1.5 圖像評價

所有模型鼠DSC MRI原始圖像傳至聯(lián)影后處理工作站，原始圖像經(jīng)過運動偽影校正，去除背景噪聲，動脈輸入函數(shù)(arterial input function，AIF)選取等獲得相對腦血流量(relative cerebral blood flow，rCBF)圖，相對腦血容量(relative cerebral blood volume，rCBV)圖。在A、B、C組每個大鼠各參數(shù)比值的測量過程中，先由2名具有10年以上神經(jīng)MRI診斷經(jīng)驗的放射科醫(yī)師翻閱DSC原始圖像后共同協(xié)商出一個測量層面，再分別獨立于B、C二組大鼠的該DSC原始圖像上沿梗死區(qū)邊緣勾畫ROI，測量并記錄rCBV，rCBF各參數(shù)值，再于對側(cè)正常鏡像區(qū)域畫取同樣大小的ROI并測量各參數(shù)值(圖1)。A組在相同解剖部位于協(xié)商獲得的層面上測量左右兩側(cè)各參數(shù)值。將測得的各參數(shù)值以梗死側(cè)/正常側(cè)(A組，右側(cè)/左側(cè))得出各參數(shù)比值(rrCBV、rrCBF)后做進一步統(tǒng)計分析。每人分別進行2次測算獲得數(shù)據(jù)，每次測量間隔一周，然后取平均值用于后續(xù)影像學(xué)檢查。

1.6 病理檢查

各亞組大鼠磁共振掃描結(jié)束后，打開腹腔，暴露腹主動脈，使用10 ml注射器進行取血，將全血放入離心管中，室溫靜置2 h后開始離心，離心機的設(shè)置為3000轉(zhuǎn)/min，10 min，4℃，使用移液槍吸取上層血清，放入凍存管內(nèi)，-80℃冰箱內(nèi)保存，待實驗結(jié)束后統(tǒng)一使用血清炎性細(xì)胞因子ELISA試劑盒檢測，血清炎性細(xì)胞因子檢測指標(biāo)分別為IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α。

1.7 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 pMCAO大鼠USPIO-DSC各參數(shù)比值(rrCBV，rrCBF)

A組、B組和C組24 h和48 h各參數(shù)比值(rrCBV，rrCBF)見表1。24 h和48 h A、B、C 3組的rrCBV (24 h：χ2=9.035，P=0.011；48 h：χ2=8.909，P=0.012)和rrCBF (24 h：χ2=9.692，P=0.008；48 h：χ2=5.333，P=0.021)均顯著不同。A組與B組比較，A組24 h亞組的rrCBV (Z=-2.236，P=0.025；)、rrCBF (Z=-2.236，P=0.025)均顯著高于B組；48 h亞組的rrCBV (Z=-2.121，P=0.034)、rrCBF (Z=-2.121，P=0.034)亦均顯著高于B組。A組與C組比較，A組24 h亞組的rrCBV (Z=-2.121，P=0.034)和rrCBF (Z=-2.121，P=0.034)均顯著高于C組。48 h亞組的rrCBV (Z=-2.121，P=0.034)、rrCBF (Z=-2.121，P=0.034)亦均顯著高C組。B組和C組比較，C組24 h亞組 rrCBV (Z=-2.205，P=0.027)和rrCBF (Z=-2.449，P=0.014) 顯著高于B組；48 h亞組rrCBV和rrCBF均顯著高于B組(Z=-2.309，P=0.021)(圖1)。

2.2 pMCAO大鼠24 h和48 h血清炎性細(xì)胞因子分析

表1 T2*WI DSC序列pMCA_O大鼠rrCBV和rrCBF的平均值(±s)Tab. 1 Values of rrCBV and rrCBF mea_sured on T2*WI DSC images of pMCAO rats (±s)

表1 T2*WI DSC序列pMCA_O大鼠rrCBV和rrCBF的平均值(±s)Tab. 1 Values of rrCBV and rrCBF mea_sured on T2*WI DSC images of pMCAO rats (±s)

組別24 h48 h rrCBV A組0.98±0.040.99±0.03 B組0.42±0.090.40±0.04 C組0.63±0.130.74±0.17 rrCBF A組0.97±0.050.98±0.04 B組0.32±0.080.27±0.05 C組0.48±0.060.46±0.11

表2 pMCAO大鼠24 h及48 h血_清炎性細(xì)胞因子均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)Tab. 2 Values of serum inflammatory cytok_ines detected on 24 h and 48 h of pMCAO rats (±s)

表2 pMCAO大鼠24 h及48 h血_清炎性細(xì)胞因子均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)Tab. 2 Values of serum inflammatory cytok_ines detected on 24 h and 48 h of pMCAO rats (±s)

組別IL-1βIL-6IL-10TNF-α 24 h A組9.415±0.954 8.257±0.885 18.439±0.870 15.784±0.709 B組27.800±2.463 15.180±5.547 20.400±1.660 20.440±1.662 C組22.040±1.645 9.682±0.818 33.300±5.450 20.400±1.520 48 h A組 11.679±1.005 11.537±0.921 16.048±0.472 13.981±2.194 B組14.860±3.101 20.960±6.354 16.370±3.300 18.830±5.152 C組12.020±0.643 13.890±3.336 22.980±4.606 13.710±1.100

表3 B組+C組大鼠24 h rrCBV、rrCBF與各炎性細(xì)胞因子相關(guān)性Tab. 3 Correlations between values of rrCBV，rrCBF and inflammatory cytokines on 24 h of B plus C groups of rats

表4 B組+C組大鼠48 h rrCBV、rrCBF與各炎性細(xì)胞因子相關(guān)性Tab. 4 Correlations between values of rrCBV，rrCBF and inflammatory cytokines on 48 h of B plus C groups of rats

表5 pMCAO大鼠24 h和48 h rrCBV、rrCBF觀察者間一致性檢驗Tab. 5 The inter-observer agreement test of rrCBV、rrCBF on 24 h and 48 h of pMCAO rats

A組、B組和C組大鼠24 h和48 h血清炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α數(shù)值見表2。A組與B組比較，A組24 h亞組的IL-1β (Z=-2.236，P=0.025)、IL-6 (Z=-2.236，P=0.025)、TNF-α (Z=-2.249，P=0.024)均顯著低于B組，IL-10 (Z=-1.65，P=0.099)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。A組48 h亞組的IL-1β (Z=-2.141，P=0.032)、IL-6 (Z=-2.121，P=0.034)均顯著低于B組。IL-10 (Z=-0.354，P=0.724)、TNF-α (Z=-1.768，P=0.077)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。A組與C組比較，A組24 h亞組的IL-1β (Z=-2.121，P=0.034)、IL-10 (Z=-2.141，P=0.032)、TNF-α (Z=-2.121，P=0.034)均顯著低于C組，IL-6 (Z=-1.62，P=0.105)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。48 h亞組的IL-1β (Z=-0.354，P=0.724)、IL-6 (Z=-0.707，P=0.480)、IL-10 (Z=-1.768，P=0.077)、TNF-α (Z=0.000，P=1.000)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。B組和C組比較，24 h亞組C組IL-1β (Z=-2.205，P=0.027)、IL-6 (Z=-1.968，P=0.049)顯著低于B組，IL-10 (Z=-2.470，P=0.014)顯著高于B 組。C組TNF-α略低于B 組(P=0.803)。48 h亞組IL-1β (Z=-2.323，P=0.02)、IL-6 (Z=-2.021，P=0.043)、TNF-α (Z=-2.309，P=0.021)顯著低于B組，IL-10 (Z=-2.021，P=0.043)顯著高于B組。

2.3 pMCAO大鼠USPIO-DSC rrCBV、rrCBF與炎性細(xì)胞因子相關(guān)性分析

B組+C組24 h和48 h各參數(shù)比值(rrCBV、rrCBF)與炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α相關(guān)性見表3、4。B組+C組24 h亞組rrCBV、rrCBF與IL-1β、IL-6呈顯著負(fù)相關(guān)，與IL-10呈顯著正相關(guān)，rrCBV與TNF-α呈顯著正相關(guān)，對相關(guān)系數(shù)進行統(tǒng)計分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。B組+C組48 h亞組rrCBV、rrCBF與IL-1β呈顯著負(fù)相關(guān)，rrCBV與IL-10呈顯著正相關(guān)，對相關(guān)系數(shù)進行統(tǒng)計分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4 pMCAO大鼠USPIO-DSC rrCBV、rrCBF觀察者間一致性檢驗

pMCAO大鼠24 h和48 h rrCBV、rrCBF觀察者間一致性檢驗見表5。

3 討論

腦梗死發(fā)生后，死亡的神經(jīng)元等腦細(xì)胞釋放損傷相關(guān)模式分子蛋白(damage associated molecular pattern molecules，DAMPs)，激活腦內(nèi)作為主要免疫效應(yīng)細(xì)胞的小膠質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)炎性反應(yīng)級聯(lián)?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞分為2大類，一類是促炎型(M1型)，釋放促炎的細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α等，一類是抗炎型(M2型)，釋放抗炎的細(xì)胞因子IL-4、IL-10等。腦梗死后炎性反應(yīng)在腦梗死的演化過程中具有雙重作用，一方面損害血腦屏障，破壞血管結(jié)構(gòu)，趨化白細(xì)胞浸潤，造成神經(jīng)血管單元的破壞和腦水腫。另一方面募集巨噬細(xì)胞吞噬梗死區(qū)死亡細(xì)胞、血管碎片等，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進血管生成和神經(jīng)血管單元重塑，改善神經(jīng)功能預(yù)后。炎性反應(yīng)是一把雙刃劍，腦梗死后適度的炎性反應(yīng)是有利的，過度的炎性反應(yīng)不利于腦組織修復(fù)，因此調(diào)控腦梗死后炎性反應(yīng)成為近些年來研究的靶點之一[13]。大量實驗研究證實[14-15]，下調(diào)促炎細(xì)胞因子IL-1β，IL-6，TNF-α的水平和上調(diào)抗炎細(xì)胞因子IL-10等的水平可以減輕tMCAO大鼠腦梗死的體積和改善神經(jīng)功能預(yù)后。針刺作為腦梗死治療的重要手段，其減輕腦梗死后炎性反應(yīng)已在眾多實驗研究中得到證實[16-19]。Geng等[16]研究發(fā)現(xiàn)針刺水溝、內(nèi)關(guān)穴能減輕腦缺血再灌注(I/R)大鼠急性期腦梗死體積，并通過上調(diào)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的表達(dá)經(jīng)由DOR-BDNF/TrkB信號通路抑制促炎細(xì)胞因子IL-1β的表達(dá)和促進抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)來抑制腦梗死后急性期炎性反應(yīng)。王金海等[19]也提出上調(diào)IL-10的表達(dá)，抑制IL-1β、IL-6等促炎細(xì)胞因子的過度表達(dá)，可能是頭穴針刺調(diào)節(jié)缺血性腦血管病炎性反應(yīng)的機制之一。本研究結(jié)果顯示大鼠腦梗死后24 h和48 h，針刺可以顯著降低大鼠血清中的促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6水平及升高大鼠血清中的抗炎細(xì)胞因子IL-10水平，另外可以降低48 h大鼠血清中的TNF-α水平，與上述實驗研究結(jié)果基本相符。

腦梗死后阻塞血管的再通以盡早恢復(fù)責(zé)任血管供應(yīng)范圍內(nèi)的血流對挽救缺血腦組織和改善神經(jīng)功能預(yù)后至關(guān)重要，目前溶栓或血管內(nèi)機械取栓是急性腦梗死治療最有效的策略之一，但由于其較窄的治療時間窗及出血等并發(fā)癥，只有約5%的患者能從中獲益，絕大多數(shù)患者急性腦梗死后梗死區(qū)及周圍血流的恢復(fù)依賴于側(cè)支循環(huán)的逆行血流，因此改善梗死區(qū)域側(cè)支循環(huán)是近些年來研究的另一重要靶點[20]。研究表明應(yīng)用血液稀釋劑降低血液黏度、誘導(dǎo)高血壓、上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)水平和內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)移植等能夠增加側(cè)支循環(huán)的早期動脈生成和晚期血管生成，增加側(cè)支循環(huán)的腦血容量和腦血流量[20]。研究證實，針刺可以改善梗死區(qū)域的側(cè)支循環(huán)[6-7，21]。Shi等[21]研究發(fā)現(xiàn)電針?biāo)疁涎軌蛎黠@增加腦缺血再灌注(I/R)大鼠腦梗死急性期梗死區(qū)及周圍腦組織的腦血流量，并通過促進梗死區(qū)及周圍微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生來促進血管生成，從而改善局部的側(cè)支循環(huán)。本研究得到了相似的結(jié)果，C組24 h和48 h大鼠梗死區(qū)的rrCBV和rrCBF均顯著高于B組，說明針刺能夠改善梗死區(qū)的側(cè)支循環(huán)。進一步研究發(fā)現(xiàn)腦梗死后急性期B組+C組24 h亞組rrCBV、rrCBF與血清IL-1β、IL-6水平呈顯著負(fù)相關(guān)，與血清IL-10水平呈顯著正相關(guān)，48 h亞組rrCBV、rrCBF與血清IL-1β呈顯著負(fù)相關(guān)，rrCBV與血清IL-10呈顯著正相關(guān)。筆者分析認(rèn)為針刺在減輕腦梗死后炎性反應(yīng)與改善側(cè)支循環(huán)表現(xiàn)出協(xié)同作用，其可能的機制與針刺調(diào)節(jié)腦梗死區(qū)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的功能有關(guān)[21-23]，針刺促進活化的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化，發(fā)揮抗炎作用，減輕血腦屏障的破壞，進一步調(diào)節(jié)鄰近星型膠質(zhì)細(xì)胞功能促進受損及新生血管血腦屏障的完善，另外針刺可以減輕血管平滑肌痙攣及促進內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，從而促進腦梗死后側(cè)支循環(huán)的動脈生成和血管生成進而增加梗死區(qū)域的腦血流量和腦血容量。本研究結(jié)果顯示B組與C組24 h亞組的TNF-α水平未見明顯差異，針刺對TNF-α調(diào)節(jié)作用始于缺血后48 h。TNF-α是具有雙重作用的細(xì)胞因子[24]，兼具有神經(jīng)毒性和神經(jīng)保護作用。TNF-α在腦梗死急性期具有擴血管及維持梗死區(qū)腦血容量的作用[25]。本研究結(jié)果提示腦梗死急性期較早的時候針刺具有選擇性調(diào)節(jié)TNF-α的可能性，但需進一步實驗研究探明。

本實驗研究有一定的局限性。首先，本次實驗造模大鼠數(shù)量較少，觀察的時間點設(shè)置較少，無法充分反映針刺對腦梗死后急性期血清炎性細(xì)胞因子及腦梗死區(qū)側(cè)支循環(huán)狀態(tài)的影響。其次，我們沒有對腦梗死區(qū)腦實質(zhì)內(nèi)的炎性細(xì)胞因子進行檢測，因而無法闡述針刺對腦梗死區(qū)腦實質(zhì)內(nèi)的炎性細(xì)胞因子的直接影響。第三，針刺減輕腦梗死后炎性反應(yīng)與改善梗死區(qū)側(cè)支循環(huán)血供的協(xié)同機制有待進一步深入研究，后續(xù)實驗研究正在進行中。

總之，本實驗研究初步證實針刺通過調(diào)控大鼠腦梗死急性期血清炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10的水平來減輕腦梗死后炎性反應(yīng)，進而改善腦梗死區(qū)側(cè)支循環(huán)血供。

利益沖突：無。