IVIM在預(yù)測高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤MGMT啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的應(yīng)用價(jià)值

田博聞，楊國強(qiáng)，秦江波，張輝*

腦膠質(zhì)瘤是具有異質(zhì)性的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，其組織學(xué)和預(yù)后存在很大差異[1]，對(duì)于高級(jí)別的腦膠質(zhì)瘤患者，手術(shù)切除聯(lián)合放化療是標(biāo)準(zhǔn)的治療方法，而目前最常用的化療靶向藥物就是替莫唑胺[2]。O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)是一種DNA修復(fù)酶，參與了細(xì)胞防御誘變和烷基化劑毒性修復(fù)的過程，導(dǎo)致腫瘤對(duì)烷基化劑產(chǎn)生抗藥性，而MGMT啟動(dòng)子的甲基化在表觀遺傳學(xué)上使MGMT基因沉默，提高腫瘤對(duì)烷基化試劑的敏感性[3]，因此攜帶MGMT啟動(dòng)子甲基化的腦膠質(zhì)瘤患者在化療后總體生存期和病情進(jìn)展時(shí)間均有所增加[4]，但是目前的實(shí)驗(yàn)室檢測主要依賴于基因分析方法，需要通過活檢或手術(shù)切除獲得腫瘤組織，而基因檢測受到了檢測費(fèi)用昂貴、檢測周期長以及腫瘤異質(zhì)性的約束[5]，因此術(shù)前無創(chuàng)性地對(duì)MGMT啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)進(jìn)行預(yù)測對(duì)于患者預(yù)后的評(píng)估以及個(gè)性化治療方案的選取有重要的臨床意義[6-7]。

擴(kuò)散和灌注磁共振成像常用于腫瘤組織的定性和治療反應(yīng)的評(píng)估[8]，體素內(nèi)不相干運(yùn)動(dòng)(intravoxel incoherent motion，IVIM)成像是一種從多個(gè)b值的擴(kuò)散加權(quán)圖像中分離定量微血管灌注信息的方法，可以在無需對(duì)比劑的情況下更準(zhǔn)確地反映腫瘤的微環(huán)境[9]，本研究旨在探討IVIM各參數(shù)對(duì)高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤MGMT啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的預(yù)測價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

回顧性收集2016年10至2019年6月在山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理確診為原發(fā)性高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤的患者34例，其中MGMT啟動(dòng)子甲基化組19例和MGMT啟動(dòng)子非甲基化組15例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)為WHO Ⅲ～Ⅳ級(jí)原發(fā)性腦膠質(zhì)瘤的患者；(2)術(shù)前均行常規(guī)MRI平掃、增強(qiáng)掃描及IVIM序列掃描檢查；(3)使用焦磷酸測序法檢測MGMT啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)并獲得準(zhǔn)確結(jié)果。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者在MRI采集和手術(shù)前進(jìn)行放化療或其他治療；(2)圖像偽影嚴(yán)重，影響參數(shù)的測量。研究的設(shè)計(jì)和方案已獲得山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 圖像采集

所有的MRI數(shù)據(jù)都是使用GE 3.0 T磁共振成像和頭頸關(guān)節(jié)八通道相控陣線圈掃描。IVIM掃描和增強(qiáng)掃描均在相同條件下進(jìn)行。T1WI增強(qiáng)掃描參數(shù)：TR 2002.20 ms，TE 24.20 ms，層厚6.0 mm，F(xiàn)OV 24 cm×24 cm；IVIM-DWI的平面回波序列(echo-planar imaging，EPI)掃描參數(shù)如下：TR 6550 ms，TE 116 ms，層厚6.0 mm，NEX為3，F(xiàn)OV 24 cm×24 cm，矩陣128×128，層間距為1.0 mm。選取的13個(gè)b值分別為：0、20、50、100、200、400、800、1200、1800、2500、3000、3500、4000 s/mm2。

1.3 MGMT啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的測定

使用焦磷酸測序法測定患者腫瘤細(xì)胞的MGMT啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，使用Simlex-OUP?FFPE DNA提取試劑盒(TIB，中國)從冷凍腫瘤組織中提取DNA，然后使用NanoDrop 2000 (Thermofisher，美國)分光光度法進(jìn)行定量，使用外延亞硫酸氫鈉試劑盒(Qiagen，德國)進(jìn)行硫酸氫鈉改性。之后采用PCR結(jié)合熱標(biāo)記Q96系統(tǒng)(Qiagen，德國)在10個(gè)CpG島進(jìn)行熱測序MGMT啟動(dòng)子內(nèi)的區(qū)域。如果CpG區(qū)域的平均甲基化率≥8%，腦膠質(zhì)瘤被定義為甲基化，否則腫瘤被認(rèn)為是非甲基化[8]。

1.4 定量參數(shù)測量及腫瘤分割

將原始圖像傳輸?shù)焦ぷ髡?advantage workstation 4.4，GE醫(yī)療系統(tǒng))，采用Functool工具包中的MADC軟件對(duì)圖像進(jìn)行后處理分析。分別獲得IVIM各參數(shù)：真擴(kuò)散系數(shù)(true diffusion coefficient，D)、灌注相關(guān)擴(kuò)散系數(shù)(perfusion related diffusion coefficient，D*)、灌注分?jǐn)?shù)(perfusion fraction，f)的偽彩圖，腫瘤組織的感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)由2名資深的影像科醫(yī)師分別參照同層面軸位增強(qiáng)T1WI所示強(qiáng)化最大區(qū)域(避開囊變、出血等)手動(dòng)勾畫，ROI大小約40～60 mm2，在最大層面及相鄰上下層面測量三次取平均值。為了避免個(gè)體差異帶來的誤差，將腫瘤實(shí)質(zhì)區(qū)各參數(shù)平均值除以對(duì)側(cè)正常腦實(shí)質(zhì)區(qū)平均值，計(jì)算得到校正后參數(shù)值：rD (relative D)、rD*(relative D*)、rf (relative f)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

分析數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，然后測試獲得數(shù)據(jù)的正態(tài)性。在校正參數(shù)定量分析中，采用組內(nèi)相關(guān)系數(shù)(intraclass correlation coefficient，ICC)來評(píng)價(jià)2名觀察者之間的一致性，當(dāng)ICC值＞0.75時(shí)則表示信度良好。對(duì)于符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，使用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，如果不符合正態(tài)分布，則使用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析，檢驗(yàn)rD、rD*、rf在MGMT啟動(dòng)子甲基化組與非甲基化組間的差異性，對(duì)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)的參數(shù)，進(jìn)一步繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線，用曲線下面積、靈敏度、特異性和相應(yīng)的最佳分界閾值，評(píng)估各參數(shù)的診斷性能。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征分析

本次研究共收集高級(jí)別腦腦膠質(zhì)瘤患者34例，其中WHO Ⅲ級(jí)(19例)，Ⅳ級(jí)(15例)，MGMT啟動(dòng)子甲基化率為55.9%(19/34)，Ⅲ級(jí)甲基化率57.9%(11/19)，Ⅳ級(jí)甲基化率53.3%(8/15)。性別比例:甲基化組19例(男11例，女8例)，非甲基化組15例(男8例，女7例)。平均年齡：甲基化組(48.73±12.13)歲，非甲基化組(52.68±12.69)歲，各組間年齡、性別以及MGMT啟動(dòng)子甲基化在Ⅲ、Ⅳ級(jí)的分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 觀察者一致性分析

觀察者間測量各校正參數(shù)的一致性良好，其中rD的觀察者間ICC值為0.914 (95% CI：0.824～0.948)；rD*的觀察者間ICC值為0.921 (95% CI：0.845～0.954)；rf 的觀察者間ICC值為0.897 (95% CI：0.818～0.925)。

2.3 影像參數(shù)分析

高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中MGMT啟動(dòng)子甲基化組中rD、rf值高于非甲基化組，rD*值低于非甲基化組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表1)。各模型所得參數(shù)ROC曲線及診斷效能見表2和圖1、2。

表1 不同MGMT啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤IVIM參數(shù)比較Tab. 1 Comparison of IVIM parameters of high-grade gliomas with different MGMT promoter methylation status

表2 IVIM參數(shù)對(duì)MGMT啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的診斷效能Tab. 2 Diagnostic efficacy of IVIM parameters on methylation status of MGMT promoter

3 討論

3.1 IVIM參數(shù)的原理及意義

磁共振擴(kuò)散加權(quán)成像(diffusion weighted imaging，DWI)使用水分子作為內(nèi)源性對(duì)比劑來評(píng)估腫瘤的擴(kuò)散率和組織微結(jié)構(gòu)，隨著磁共振(magnetic resonance，MR)設(shè)備的不斷發(fā)展及對(duì)DWI研究的深入，通過設(shè)置較大范圍內(nèi)多個(gè)b值進(jìn)行DWI掃描，并基于雙指數(shù)模型可以分離水分子運(yùn)動(dòng)相關(guān)的擴(kuò)散及灌注參數(shù)，有助于更好的分析組織特征和治療監(jiān)測。大量文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)b值＜200 s/mm2且大于4個(gè)時(shí)能更有效準(zhǔn)確地反映灌注相關(guān)信息[10-11]。關(guān)于IVIM參數(shù)的生理基礎(chǔ)，有學(xué)者認(rèn)為D、D*和f分別對(duì)應(yīng)組織擴(kuò)散率、毛細(xì)血管血流速度和毛細(xì)血管血流的分?jǐn)?shù)體積，根據(jù)灌注分?jǐn)?shù)乘以灌注相關(guān)擴(kuò)散系數(shù)的乘積可以估算出灌注量[9，12]。

3.2 擴(kuò)散參數(shù)的相關(guān)分析

本研究表明MGMT啟動(dòng)子甲基化組較非甲基化組有更高的rD值，并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與Moon等[13]的研究結(jié)果相同，高的rD值表示甲基化組的腫瘤細(xì)胞密度低，細(xì)胞間隙大以及水分子擴(kuò)散受限程度更輕。推測可能的原因是MGMT是一個(gè)人體正常存在的自我修復(fù)蛋白，可以防止細(xì)胞內(nèi)基因突變，進(jìn)而細(xì)胞凋亡的一種修復(fù)酶。而MGMT啟動(dòng)子甲基化后，沉默了MGMT基因的啟動(dòng)序列，使其處于停滯狀態(tài)無法正常轉(zhuǎn)錄翻譯，導(dǎo)致細(xì)胞中的MGMT蛋白合成減少，損傷和突變的基因序列不能被MGMT蛋白修復(fù)而變形失活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡[14]。也有研究表明MGMT啟動(dòng)子甲基化會(huì)增加DNA的不穩(wěn)定性，使得DNA更容易發(fā)生突變和裂解，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡，所以MGMT啟動(dòng)子甲基化的腫瘤細(xì)胞密度更小，rD值更高，提示其具有更好地預(yù)后。此外Rundle-Thiele等[15]對(duì)于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的患者做了進(jìn)一步的研究，他們使用直方圖統(tǒng)計(jì)法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出的結(jié)果是MGMT啟動(dòng)子甲基化組的腫瘤細(xì)胞具有更低的擴(kuò)散參數(shù)，水分子擴(kuò)散受限程度更重，與本研究結(jié)果不同，這可能是由于方法的不同所導(dǎo)致，包括ROI的選擇、統(tǒng)計(jì)分析和不同的分組(高級(jí)別膠質(zhì)瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)。

3.3 灌注參數(shù)的相關(guān)分析

MGMT啟動(dòng)子甲基化組與非甲基化組相比，出現(xiàn)了rD*值的降低和rf值的升高。rD*與腫瘤內(nèi)毛細(xì)血管的生成及血流量有關(guān)，表示MGMT啟動(dòng)子甲基化組較非甲基化組有更低的灌注，與Ryoo等[16]的研究結(jié)果一致，說明在甲基化組中微循環(huán)灌注更低，毛細(xì)血管生成更少，提示腫瘤具有更弱的侵襲性。Chahal等[17]認(rèn)為，MGMT參與了腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展，MGMT陽性細(xì)胞的血管內(nèi)皮生長因子受體水平較高，而血管內(nèi)皮生長因子與受體的結(jié)合能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與存活，從而加速了腫瘤血管的生成與發(fā)育，所以當(dāng)MGMT啟動(dòng)子甲基化后使得MGMT基因沉默，減少了腫瘤內(nèi)血管的生成，進(jìn)而解釋了甲基化組的腫瘤內(nèi)毛細(xì)血管的生成減少，血流量降低，rD*值降低原因。

MGMT啟動(dòng)子甲基化組較非甲基化組有較高的f值，提示其具有更高的灌注占比，有研究表明，f值與動(dòng)態(tài)對(duì)比增強(qiáng)磁共振成像(dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging，DCE-MRI)中的容積轉(zhuǎn)運(yùn)常數(shù)(volume transfer constant，Ktrans)值有強(qiáng)相關(guān)性[18]，預(yù)示著兩者機(jī)制之間有相似之處，Ktrans值是表示微血管通透性相關(guān)參數(shù)。而AHN等研究發(fā)現(xiàn)，MGMT啟動(dòng)子甲基化組有更高的Ktrans值，可能是由于Ktrans值增加意味著替莫唑胺更容易滲透，從而導(dǎo)致治療成功率的增加以及更好的預(yù)后表現(xiàn)[19]，所以筆者認(rèn)為f值的升高可能是由于在同等灌注下，MGMT啟動(dòng)子甲基化組具有更高的毛細(xì)血管通透性，導(dǎo)致其灌注分?jǐn)?shù)升高，表示其具有更高的血藥交換率，這與也與臨床上研究的甲基化組的腫瘤對(duì)替莫唑胺有更高的敏感性一致，還有研究表明在高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中高Ktrans值患者的生存期更長[20]，因此f值對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者生存期的預(yù)測也有重大的潛力。

然而，這項(xiàng)研究仍有一些局限性，主要包括以下幾點(diǎn)：(1)研究中心為單中心且樣本規(guī)模小不具有代表性；(2)感興趣區(qū)的劃取和腫瘤標(biāo)本的切片區(qū)域不符合，導(dǎo)致的空間異質(zhì)性帶來的誤差；(3)多b值的選取也不是最佳選擇。

綜上所述，IVIM能無創(chuàng)評(píng)估腦膠質(zhì)瘤MGMT啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，其中rD*的靈敏度較高，有助于指導(dǎo)高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤患者的個(gè)性化診治方案以及對(duì)預(yù)后的評(píng)估。

利益沖突：無。