高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定冷凍飲品中的5種季銨鹽

潘項捷，張水鋒，盛華棟，焦玉芬，施元旭，馮婷婷

(浙江方圓檢測集團(tuán)股份有限公司，浙江 杭州 310018)

季銨鹽化合物(Quaternary ammonium compounds，QACs)是一類銨離子中的4個氫原子均被烴基取代而生成的化合物，其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)根據(jù)與氮原子相連取代基性質(zhì)的不同而不同[1]，具有廣譜抗菌活性，被作為消毒劑和清潔劑廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生和食品工業(yè)領(lǐng)域[2-4]。根據(jù)我國衛(wèi)生部印發(fā)的《食品用消毒劑原料(成份)名單(2009版)》，C12～C16烷基二甲基芐基氯化銨(C12-16-BAC)，雙癸基二甲基氯化銨(DDAC)等均可用于食品加工設(shè)備和容器的消毒[5]。在食品工業(yè)中，清潔消毒過程對于消除微生物必不可少，通常使用季銨鹽化學(xué)品[6]。但如果清潔操作不當(dāng)，特別在用水沖洗不充分情況下，這些化合物的殘留物會持續(xù)存在于食品表面，從而成為食物污染的潛在來源。研究報道一些季銨鹽能影響人類的健康，刺激皮膚和眼睛[7]，具有生殖毒性[8]。歐洲食品安全局規(guī)定季銨鹽DDAC和BAC的最大殘留值為0.1 mg/kg。根據(jù)德國風(fēng)險評估所數(shù)據(jù)顯示，季銨鹽在多種食品中被檢出，其中DDAC在冰淇淋中的含量最高[9]。我國尚未建立冷凍飲品中季銨鹽類消毒劑殘留的限量和國家檢測標(biāo)準(zhǔn)，因此建立冰淇淋、雪糕等冷凍飲品中季銨鹽類消毒劑殘留的準(zhǔn)確、靈敏分析方法具有重要意義。

目前有關(guān)季銨鹽類的常見檢測方法主要有紫外-可見光分光光度法[10]、毛細(xì)管電泳法[11]、液相色譜法[12]、氣相色譜-質(zhì)譜法[13-14]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[15-17]等。近年來，質(zhì)譜法被廣泛用于蔬菜、水果和奶粉等各類食品中季銨鹽殘留的檢測[18-19]，而HPLC-MS/MS則因其靈敏度高，選擇性好，抗干擾能力強(qiáng)，分析速度快，在各類化合物的檢測分析中得到廣泛應(yīng)用[20]。本文建立了冷凍飲品中十二烷基二甲基芐基氯化銨(C12-BAC)、十四烷基二甲基芐基氯化銨(C14-BAC)、十六烷基二甲基芐基氯化銨(C16-BAC)、十二烷基三甲基氯化銨(DTAC)和DDAC 5種季銨鹽殘留的HPLC-MS/MS檢測方法，該方法前處理簡單，分析周期短，靈敏度高，為冷凍飲品中季銨鹽殘留的檢測提供了技術(shù)參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Sciex QTRAP 5500三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國 SCIEX公司)；Eyela N-1218BV旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化器械株式會社)；ST16R高速冷凍離心機(jī)(美國賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；N-EVAP氮吹儀(美國Organomation公司)；VG3 S025渦旋混合器(德國IKA儀器設(shè)備有限公司)；HY-2A調(diào)速振蕩器(江蘇金壇榮華有限公司)；BCD-218冷藏冷凍冰箱(中國海爾集團(tuán)公司)；PM5-2000TD超聲波清洗器(英國普律瑪公司)。

C12-BAC(純度94.6%，德國Dr.Ehrenstorfer)；C14-BAC(≥98.0%，德國CNW Technologies)；C16-BAC(≥95.0%，德國CNW Technologies)；DTAC(98.0%，中國南京化學(xué)試劑股份有限公司)；DDAC(93.9%，德國Dr.Ehrenstorfer)；乙酸乙酯(色譜純，美國TEDIA公司)；乙腈、甲醇(色譜純，德國Merck公司)。

1.2 樣品前處理

冷凍飲品融化混勻后，稱取樣品2 g至50 mL離心管中，加入20 μL甲酸，渦旋混勻1 min，加入10 mL乙腈-乙酸乙酯(1∶1)，2 g無水硫酸鎂，渦旋振蕩提取10 min，于8 000 r/min離心5 min，上清液移入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，重復(fù)提取1次，合并提取液在45 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至約0.5 mL，于45 ℃下氮?dú)獯蹈?，加? mL甲醇溶解，渦旋1 min，放入-20 ℃冷凍箱中，冷凍1 h，取甲醇層過0.22 μm濾膜，供HPLC-MS/MS測定。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱取適量5種季銨鹽標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成1 000 mg/L的單標(biāo)儲備液?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)儲備液(1.0 mg/L)的配制：準(zhǔn)確移取5種季銨鹽單標(biāo)儲備液100 μL于100 mL容量瓶，甲醇定容，4 ℃保存。基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：按照“1.2”方法獲得空白基質(zhì)溶液，因冰淇淋、雪糕等冷凍飲品的主要配料是牛奶，因此選取牛奶作為基質(zhì)。將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液用牛奶空白基質(zhì)配制成0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，過0.22 μm濾膜，待測。

1.4 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜分析柱選擇資生堂CAPCELL PAK CR(1∶20)(2.0 mm×150 mm，3 μm)。流動相A為乙腈，B為5 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)；柱溫：35 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL；梯度洗脫程序：0～1 min，60%A；1～3 min，60%～80%A；3～7 min，80%A；7～8 min，80%～60%A；8～10 min，60%A。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI);掃描模式：正離子掃描；離子源溫度(TEM)：550 ℃；霧化氣壓力(GS1)：413 kPa；輔助氣壓力(GS2)：413 kPa；氣簾氣壓力(CUR)：241 kPa；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。5種季銨鹽的質(zhì)譜條件見表1。

表1 5種季銨鹽的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of 5 QACs

圖1 5種季銨鹽的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formulas of 5 QACs

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜與色譜條件的優(yōu)化

5種季銨鹽在水溶液中存在高峰度的[M-Cl]+母離子，3種含有芐基的季銨鹽(C12-BAC，C14-BAC和C16-BAC)易在芐基和季胺間發(fā)生鍵斷裂，產(chǎn)生芐基片段m/z91和對應(yīng)的[NR3]+片段(m/z212.0、m/z240.0和m/z268.0)，而DDAC和DTAC容易去除烷基，產(chǎn)生高響應(yīng)的[NR3]+片段(m/z186.0和m/z60.0)。根據(jù)歐盟(EU)的2002/657/EC指令，選擇1個母離子和2個主要特征碎片離子作為定性和定量離子對，優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)(見表1)，5種季銨鹽的分子結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖2 5種季銨鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatogram of 5 QACs standard solution

實驗嘗試采用Agilent ZORBAX C18和Waters ACQUITY BEH C18柱對待測物進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)5種季銨鹽的峰形拖尾嚴(yán)重，這可能是由于5種季銨鹽均含有較長的碳鏈，容易被C18色譜柱的填料吸附，較難洗脫。文獻(xiàn)報道使用具有親水作用的Hilic正相色譜柱，以乙腈-乙酸銨為流動相時能獲得合適的保留時間和對稱的峰形。但Hilic柱的平衡時間長，重復(fù)性較差。本實驗采用混合了C18填料和強(qiáng)陽離子交換(SCX)填料的CAPCELL PAK CR(1∶20)色譜柱，基于陽離子交換和反相雙重作用機(jī)理[21]，可獲得分離效果好，保留時間合適，峰形對稱的5種季銨鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖(如圖2)。

2.2 樣品前處理的優(yōu)化

2.2.1 提取劑的選擇文獻(xiàn)報道食品中季銨鹽的提取常采用QuEChERS方法[22]，常見的提取劑為乙腈。考慮到冷凍飲品中常含有巧克力等脂肪含量高的物質(zhì)，結(jié)合季銨鹽類化合物含有長鏈烷烴，且具親脂性，本實驗選擇乙腈和乙酸乙酯作為提取溶劑，在牛奶基質(zhì)中添加10 μg/kg 5種季銨鹽，比較了乙腈、乙腈-乙酸乙酯(2∶1)、乙腈-乙酸乙酯(1∶1)、乙腈-乙酸乙酯(1∶2)和乙酸乙酯5種溶劑的提取效果。結(jié)果顯示，乙腈中加入一定量乙酸乙酯時，DDAC的回收率更好。當(dāng)乙酸乙酯含量超過50%時，5種季銨鹽的相對強(qiáng)度均明顯下降，回收率降低(見圖3)，這可能是乙酸乙酯提取較多的脂溶性物質(zhì)所致?？紤]到冷凍飲品基質(zhì)，實驗最終選擇乙腈-乙酸乙酯(1∶1)為提取溶劑，重復(fù)提取2次。

圖3 提取劑種類對5種季銨鹽提取效率的影響Fig.3 Effect of extraction type on extraction efficiencies of 5 QACs

2.2.2 凈化條件的優(yōu)化QuEChERS法提取季銨鹽已有較多的報道，常見的凈化吸附劑有N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化炭黑(GCB)和十八烷基鍵合硅膠(C18)。有學(xué)者比較上述幾種凈化劑對奶粉中季銨鹽的吸附效果，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用PSA時的回收率最高，而C18和GCB會吸附季銨鹽，導(dǎo)致回收率降低[23]。另有文獻(xiàn)比較了3種固相萃取柱HLB、MCX和WCX的凈化效果，發(fā)現(xiàn)使用WCX柱時，BAC和DDAC的回收率較高[24]。本實驗考察了一種簡單的凈化方式—冷凍脫脂法[25]：提取后的物質(zhì)用甲醇定容后，直接于-20 ℃冷凍1 h。此低溫條件下，脂類物質(zhì)在甲醇中的溶解度因降低而析出，取上層清液，過0.22 μm濾膜除去產(chǎn)生的絮狀漂浮物和沉淀物，上機(jī)測試，同時與采用Oasis WCX柱的凈化結(jié)果進(jìn)行比較，以牛奶基質(zhì)加標(biāo)20.0 μg/kg為例，發(fā)現(xiàn)5種季銨鹽在2種凈化方式下得到的回收率均在86%～96%之間，滿足檢測及定量需求。本實采用簡單的冷凍脫脂方法對樣品進(jìn)行凈化。

2.3 方法學(xué)評價

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)本文采用基質(zhì)配制校準(zhǔn)曲線斜率與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線斜率的比值，對5種季銨鹽在2種典型樣品(牛奶和雪糕)中的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行考察，其比值越接近1，則基質(zhì)效應(yīng)越小[26]。由表2可知5種季銨鹽的基質(zhì)效應(yīng)(斜率比值)為0.99～1.11，表明基質(zhì)效應(yīng)小，但考慮到冷凍飲品的種類繁多，且多數(shù)添加了牛奶奶粉，因此選擇牛奶基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。

表2 5種季銨鹽的基質(zhì)效應(yīng)、線性方程、相關(guān)系數(shù)(r)、檢出限及定量下限Table 2 Matrix effects，solvent calibration curves,matrix-matched calibrations,correlation coefficients(r),LODs and LOQs of 5 QACs

2.3.2 線性范圍、檢出限及定量下限配制5種季銨鹽的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化條件下，通過HPLC-MS/MS測定后，以季銨鹽的質(zhì)量濃度(x，μg/L)為橫坐標(biāo)，各化合物定量離子對的峰面積(y)為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，5種季銨鹽均在0.5～50.0 μg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.995，分別以信噪比(S/N)為3和10時計算方法的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，測得檢出限為0.3～1.5 μg/kg，定量下限為1.0～5.0 μg/kg。

2.3.3 準(zhǔn)確度與精密度在2種空白牛奶和雪糕基質(zhì)中進(jìn)行5種季銨鹽混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的加標(biāo)回收實驗，加標(biāo)水平為5.0、10.0、50.0 μg/kg，每個濃度平行測定6次，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果顯示，在3個加標(biāo)水平下5種季銨鹽的回收率為80.3%～114%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)<10%(見表3)，符合檢測要求。

表3 樣品中5種季銨鹽的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of 5 QACs in sample(n=6)

圖4 典型陽性樣品的提取離子色譜圖Fig.4 Extracted ion chromatogram of a typical positive sample

2.3.4 實際樣品的檢測采用本文建立的方法對本地區(qū)流通市場上抽檢的39批次冷凍飲品(主要包括冰淇淋、雪糕和棒冰等)進(jìn)行測定。結(jié)果顯示：有25批次樣品檢出C12-BAC和C14-BAC，含量為1.5～15.0 μg/kg。3批次樣品檢出DDAC，含量為2.5～20.5 μg/kg，說明冷凍飲品中存在季銨鹽殘留污染。某典型陽性樣品的提取離子色譜圖如圖4所示。

3 結(jié) 論

本文建立了一種冷凍飲品中5種季銨鹽的HPLC-MS/MS分析方法。通過優(yōu)化提取試劑，選擇乙腈-乙酸乙酯(1∶1)為提取溶劑，采用冷凍脫脂凈化后，使用CAPCELL PAK CR(1∶20)柱實現(xiàn)了5種季銨鹽的分離，并采用基質(zhì)匹配外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。該方法操作簡便，靈敏度高，精密度良好，適用于冷凍飲品中5種季銨鹽殘留的定量分析。