甲狀腺過氧化物酶抗體光激化學發(fā)光間接檢測法的建立

金 鑫 陳紅霞

(上海大學生命科學學院，上海 200444)

光激化學發(fā)光是以納米級高分子微粒為基礎的新一代化學發(fā)光技術，在免疫檢測中應用前景廣闊。具有快速、均相(免沖洗)、高靈敏和操作簡單的特點[1]。因其方法的核心特點為均相免沖洗(分離)模式，所以在實際運用中采用夾心法或者競爭法等可一步完成反應。目前還未在光激化學發(fā)光平臺上有間接法檢測的應用。

甲狀腺過氧化物酶(thyroid peroxidese，TPO)是一種糖基化血紅素蛋白，是甲狀腺細胞上的跨膜蛋白，其膜外區(qū)的部分酶具有催化活性[2]。甲狀腺過氧化物酶抗體(Anti-TPO)的檢測始于20世紀80年代，1985年Czarnocka等首先證實純化的微粒體抗原就是TPO，隨后建立了競爭性與非競爭性Anti-TPO免疫分析法(非競爭法多為間接法)[3]。目前Anti-TPO的檢測已經(jīng)成為臨床自身診斷免疫性甲狀腺疾病，尤其是橋本氏甲狀腺病的重要參考指標[4]。檢測Anti-TPO的主流方法有酶聯(lián)免疫分析、化學發(fā)光免疫分析、時間分辨熒光免疫分析等[5]。

本研究通過制備免疫復合物IgG的多抗，將發(fā)光微粒偶聯(lián)TPO，生物素標記抗免疫復合物IgG抗體，建立了一步間接法用于檢測人血清Anti-TPO濃度的光激化學發(fā)光免疫檢測分析方法，并進行了該方法的性能評估。該Anti-TPO檢測法在Lica平臺上實現(xiàn)了間接檢測，也對現(xiàn)有的Anti-TPO檢測起到了方法學上的補充作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗材料與試劑 人IgG和BCATM Protein Assay Kit購自賽默飛公司；乙肝核心抗原購自深圳菲鵬公司；重組TPO購自DIARECT AG；Anti-TPO國家標準品購自中國食品藥品檢定研究院；96孔反應微孔板購自浙江拱東醫(yī)療科技有限公司；發(fā)光微粒和Lica通用液(鏈霉親和素包被的感光微粒)由博陽生物科技(上海)有限公司提供；伯樂質控品購自美國Bio-Rad公司；Biotin-NHS購自Sigma公司。

1.1.2主要儀器 CR21G高速冷凍離心機，自日立公司；Lica 500自動光激化學發(fā)光檢測儀由嘉興凱實公司提供；粒徑儀Nicomp 370、酶標儀(型號MK3)購自賽默飛公司。

1.2方法

1.2.1人IgG免疫耐受建立 根據(jù)文獻[6]將100 mg的人IgG溶解于5 ml的生理鹽水后與經(jīng)過抗凝處理的5×109個兔紅細胞混合，1 000 r/min離心5 min分離兔紅細胞，從而去除能與兔紅細胞特異性識別并結合的IgG。將上清液超速離心(15 000 r/min)90 min，取上層1/3的液體，得到處理后的人IgG溶液(去除IgG多聚物，IgG多聚物注射進體內傾向于產生免疫反應而非耐受)。將處理后的人IgG溶液透析至生理鹽水，并稀釋至10 mg/ml，經(jīng)兔耳緣靜脈注射1 ml人IgG，通常在1周后兔子可以產生免疫耐受，該耐受持續(xù)時間可以達到45 d以上，因此選擇在免疫2周后使該兔子處于免疫耐受條件下進行后續(xù)實驗。

1.2.2免疫復合物IgG制備及免疫 用5 ml注射器預先吸取2 ml用于保存紅細胞的阿氏液(取20.5 g葡萄糖、8 g檸檬酸鈉、0.55 g檸檬酸、4.2 g氯化鈉，溶于1 L純水。將配制好的溶液高壓滅菌15 min，冷卻后放置于4℃環(huán)境內，保存?zhèn)溆?，從兔耳緣靜脈抽取兔全血2～3 ml并輕輕混勻[7]；將抗凝的兔全血轉移至15 ml離心管，加滿生理鹽水混勻后1 000 r/min離心5 min；棄上清，重新加入生理鹽水并混勻，1 000 r/min離心5 min，重復上述清洗步驟3遍，得兔紅細胞，并計數(shù)。取2×109個兔紅細胞，加入5 ml正常人血清(預先經(jīng)凝集反應篩選)，混勻后室溫反應15 min，混勻；1 000 r/min離心5 min，棄上清；沉淀加生理鹽水，混勻，1 000 r/min離心5 min，清洗3遍，加生理鹽水至終體積2 ml，免疫復合物IgG制備完成。

在上述經(jīng)過免疫耐受的兔子背部多點注射兔紅細胞免疫復合物IgG，1周后重復以上操作，再次免疫，共免疫4次[8]。

1.2.3抗免疫復合物IgG抗體的分離和純化 心臟取血，對血清中的抗免疫復合物IgG抗體進行純化，其原理利用抗免疫復合物IgG抗體可以識別免疫復合物的特點，通過偶聯(lián)免疫復合物填料的親和柱將抗免疫復合物IgG抗體進行分離純化。具體過程是首先制備乙肝核心抗原偶聯(lián)填料的親和柱，用乙肝核心抗體陽性血清通過該親和柱，乙肝核心抗體和乙肝核心抗原會形成免疫反應，使親和柱表面形成乙肝核心抗原-乙肝核心抗體的免疫復合物，再將需進行純化的兔血清過此親和柱，使兔血清中抗免疫復合物IgG抗體識別乙肝核心抗原-乙肝核心抗體的免疫復合物并結合至該親和柱，用PBS(pH7.4)洗滌，并用0.1 mol/L甘氨酸(pH3.0)緩沖液將形成免疫反應的抗體洗脫。洗脫液用PBS(pH7.4)透析，透析后的洗脫液中會包含乙肝核心抗體(人抗體)及抗免疫復合物IgG抗體(兔抗體)。再將以上透析后的洗脫液經(jīng)過人體IgG免疫親和柱(吸附其中的乙肝核心抗體)，收集穿透液即為抗免疫復合物IgG抗體，用BCATM Protein Assay Kit檢測該抗免疫復合物IgG抗體的蛋白濃度，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4發(fā)光微粒偶聯(lián)TPO 取10 mg粒徑為200 nm的發(fā)光微粒(微粒表面有活性醛基，濃度為20.5 mg/ml)，離心去上清，超聲分散至0.1 mol/L、pH8.6的碳酸氫鈉緩沖液中，按照發(fā)光微粒和蛋白10∶0.1加入TPO(0.1 mg)，加入氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)還原，37℃反應過夜，離心去上清，清洗未結合在發(fā)光微粒表面的TPO，離心清洗完成后用PBS將偶聯(lián)上TPO的發(fā)光微粒定容至10 mg/ml，作為發(fā)光珠包被濃溶液4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5生物素標記抗免疫復合物IgG抗體 取1 mg 的抗免疫復合物IgG抗體，抗體和生物素以1∶30(摩爾比)比例加入生物素(Biotin-NHS)，4℃混合反應過夜，用透析的方法去除未結合在蛋白上的生物素，將生物素標記好的抗免疫復合物IgG抗體定容至1 mg/ml，作為生物素標記濃溶液，4℃保存，備用。

1.2.6研制試劑的反應原理 研制試劑包括發(fā)光微粒偶聯(lián)TPO的發(fā)光微粒試劑，生物素標記抗免疫復合物IgG抗體的生物素標記試劑輔以鏈霉親和素(SA)包被感光微粒的Lica通用液進行檢測。當樣品中存在Anti-TPO時，加入發(fā)光微粒試劑和生物素標記試劑后會形成發(fā)光微粒-TPO-Anti-TPO-生物素標記抗免疫復合物IgG抗體的復合體，再加入Lica通用液后，會形成發(fā)光微粒-TPO-Anti-TPO-生物素標記抗免疫復合物IgG抗體-SA-感光微粒的復合體。從而使得發(fā)光微粒和感光微粒緊密聯(lián)系，在680 nm激發(fā)光下，完成化學發(fā)光過程。

1.2.7定標品的制備 用含1%BSA的PBS將Anti-TPO國家標準品進行稀釋，配制成0、10、30、120、400、1 400 U/ml的定標品，分裝成0.5 ml/管，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8檢測方法 將發(fā)光珠包濃溶液用0.02 mol/L HEPES緩沖液(pH8.0,1%BSA)稀釋到40 μg/ml，作為發(fā)光微粒試劑；將生物素標記濃溶液用0.05 mol/L Tris緩沖液(pH值8.0,0.1%BGG)稀釋到1 μg/ml，作為生物素標記試劑。

在96孔反映微孔板中，每孔依次加入定標品或待測樣品10 μl、發(fā)光微粒試劑50 μl、生物素標記試劑50 μl，然后將微孔板置于LiCA HT光激化學發(fā)光檢測儀內，第一步溫育設定為37℃溫育900 s，LiCA通用液加液量設置為175 μl，其后在37℃溫育600 s后，進行信號采集及讀數(shù)。

1.2.9檢測方法的評價

1.2.9.1最低檢測限 最低檢測限是指區(qū)別于零點的最低分析物濃度。重復檢測20孔定標品1(0 U/ml)，計算其RLU均值(AVE)和標準偏差(SD)，以AVE+2SD反代入標準曲線，得到的濃度值即為本檢測方法的最低檢測限。

1.2.9.2回收率 取已知濃度1 000～1 200 U/ml的患者血清樣品，對其連續(xù)5次對倍稀釋，測定每次稀釋后的樣品濃度，并與其理論濃度進行比較，計算每次稀釋的回收率?；厥章?(實測值/理論值)×100%

1.2.9.3重復性(精密度) 檢測伯樂質控低、中、高3個水平(伯樂質控品批號：Level 1 lot:60201,Level 2 lot:60202,Level 3 lot:60203)的重復性，將伯樂質控低、中、高3個水平各平行做20孔，計算變異系數(shù)(CV)。

1.3統(tǒng)計學分析 取117份臨床患者血清樣本，分別用本研究建立的Anti-TPO檢測試劑(光激化學發(fā)光法)和貝克曼試劑(化學發(fā)光法)進行檢測，將兩種方法的測值結果進行相關性分析。

2 結果

2.1最低檢測限 最低檢測限具體計算結果見表1、2，通過總標線計算，最終檢測限為0.09 U/ml。

表1 定標曲線Tab.1 Calibration curve

2.2回收率 取已知測值為1 098.25 U/ml的患者血清，將其連續(xù)5次對倍稀釋，測定每次稀釋后的樣品值，測定結果如表3,回收率分別為98.86%、98.55%、96.58%、95.10%和92.19%，結果均分布在90%～110%之間，平均回收率為96.26%。

表2 定標品1檢測結果Tab.2 Result of calibration 1

表3 已知Anti-TPO濃度的血清檢測回收率Tab.3 Recovery ratio analysis of serum

2.3重復性(精密度) 對伯樂質控品3個濃度水平樣品各檢測20孔，進行相關的精密度計算，測定結果見表4，可知level 1～3的重復性分別為1.58%、1.97%、1.73%，重復性均小于5%，表現(xiàn)良好。

表4 精密度分析Tab.4 Precision analysis

2.4方法學相關性分析 相關性曲線見圖1，直線方程為y=1.027x+2.463，相關系數(shù)r為0.989，大于0.975，斜率為0.9～1.1，符合要求。實驗結果表明，兩種檢測方法具有較好的相關性。

圖1 本研究新建方法與貝克曼化學發(fā)光法相關性分析Fig.1 Correlation analysis between newly-established method in this study with Beckman test

3 討論

光激化學發(fā)光反應是一種均相免疫反應[9]。在兩種微粒表面包被抗原或抗體，通過免疫反應將兩種微粒拉近，從而使得單線態(tài)氧從感光珠表面?zhèn)鬟f至發(fā)光珠表面，致使發(fā)光珠發(fā)光。因此，該方法的最大特點就是均相反應無需清洗和分離，但造成了間接法很難在該平臺上使用。

傳統(tǒng)的間接法檢測Anti-TPO，是將TPO抗原進行包被，與樣本先進行反應。如果樣本中有Anti-TPO，其會與包被抗原進行反應，然后通過洗滌將與包被抗原反應的抗體和未反應的其他抗體進行分離。再加入標記的抗人IgG的二抗，實現(xiàn)對人血清中的Anti-TPO的活性濃度的檢測。

本研究通過使用抗免疫復合物抗體作為標記抗體，實現(xiàn)了對TPO及其抗體形成的免疫復合物的特異性識別，從而實現(xiàn)了一步法免清洗的免疫間接法檢測，并將其成功應用于Lica平臺。

通過最終性能的檢測評估，本方法設計的光激化學發(fā)光定量檢測甲狀腺過氧化物酶抗體的方法(間接法原理)與傳統(tǒng)化學發(fā)光法的相關性較好，最低檢測限、回收率和精密度等指標也符合臨床需求。

隨著免疫檢測技術的發(fā)展，均相免洗的免疫檢測方法的優(yōu)勢會越來越明顯，由于均相免洗帶來的操作便捷，檢測重復性好，靈敏度高等優(yōu)勢正是現(xiàn)在免疫技術的關注焦點[10]。而均相技術在檢測抗體時難以使用間接法檢測的問題也會限制研發(fā)人員對這些技術的應用。通過使用抗免疫復合物抗體，本研究成功地在Lica平臺上實現(xiàn)了間接法檢測Anti-TPO。同樣本研究也可以采取該技術手段在Lica平臺上實現(xiàn)類似與Anti-TPO等其他抗體的間接法檢測。甚至可以將其推廣到其他的均相免洗的免疫檢測方法中去。