蛋氨酸腦啡肽聯(lián)合紫杉醇對(duì)肺癌細(xì)胞A549增殖和凋亡的影響

陳 灝 呼芳竹 鄧煜瑤 王曉楠 單風(fēng)平

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,沈陽(yáng) 110122)

全球癌癥的發(fā)病率和死亡率迅速上升，使癌癥成為大多數(shù)地區(qū)的主要死因。而其中，肺癌是最常診斷的癌癥，也是全球癌癥死亡的主要原因。根據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，肺癌占新發(fā)癌癥總數(shù)的11.6%，占癌癥總死亡人數(shù)的18.4%，發(fā)病率和死亡率均排名第一[1，2]。約85%的肺癌患者是非小細(xì)胞型肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)，腺癌和鱗狀細(xì)胞癌是其最常見的亞型。臨床上，超過(guò)60%的肺癌患者在診斷時(shí)出現(xiàn)局部晚期或轉(zhuǎn)移性疾病，手術(shù)切除不再是最佳選擇，此時(shí)肺癌患者的主要治療方法是常規(guī)化學(xué)療法和放射療法[3]。紫杉醇(paclitaxel，PTX)是一種用于治療癌癥的有效藥物，廣泛應(yīng)用于NSCLC的臨床治療。但是，PTX也具有嚴(yán)重的副作用，包括嘔吐、腹瀉和骨髓抑制[4]。近年來(lái)，藥物聯(lián)合用是降低細(xì)胞毒性并且提高療效的有效方法。因此，研究新型抗腫瘤藥物與傳統(tǒng)化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用方案，對(duì)于肺癌治療具有十分重要的意義。

蛋氨酸腦啡肽(methionine enkephalin，MENK)是衍生自腎上腺素原激素腦啡肽的內(nèi)源性阿片樣五肽，具有Try-Gly-Gly-Phe-Met氨基酸序列，也稱為阿片生長(zhǎng)因子。MENK不僅具有神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫調(diào)節(jié)活性，而且在與阿片受體結(jié)合后也具有直接的抗腫瘤活性[5]。根據(jù)既往研究報(bào)道，MENK可抑制胃癌、胰腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肝細(xì)胞癌和三陰性乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)[6]。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MENK對(duì)肺癌A549細(xì)胞的增殖具有抑制作用。因此，本文以肺癌A549細(xì)胞為研究對(duì)象，旨在探討MENK聯(lián)合PTX對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 肺癌A549細(xì)胞由我院實(shí)驗(yàn)室傳代保存，用含有10%胎牛血清和1%的青霉素、鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2孵箱中傳代培養(yǎng)。

1.1.2藥物與試劑 MENK購(gòu)于美國(guó)Penta Biotech公司；PTX購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)HyClone公司；CCK-8試劑盒、青霉素鏈霉素雙抗、0.25%胰酶均購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購(gòu)于天津市灝洋生物制品公司；Hoechst33258試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，輕輕吹打混勻制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后按照5×103個(gè)/孔接種于96孔板，每孔加入200 μl培養(yǎng)基。24 h后各組吸去培養(yǎng)基，分別加入相應(yīng)的藥物。單藥組每孔加入200 μl MENK或200 μl PTX；聯(lián)合用藥組MENK和PTX藥物濃度均濃縮1倍后，每孔分別加入100 μl藥物，使得終濃度與單藥組相同。具體分組為：MENK組(2 mg/ml、6 mg/ml、10 mg/ml)，PTX組(2 ng/ml、6 ng/ml、10 ng/ml),MENK聯(lián)合PTX組(2 mg/ml+2 ng/ml、6 mg/ml+6 ng/ml、10 mg/ml+10 ng/ml)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組，加入200 μl RPMI1640培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h，48 h后，加入CCK-8試劑，按照10∶1加入CCK-8試劑，以換液的形式加入。放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，在酶標(biāo)儀上用450 nm的波長(zhǎng)測(cè)出各組OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2藥物聯(lián)合應(yīng)用效應(yīng)評(píng)價(jià) 每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置5個(gè)不同的濃度，分別為MENK組(2 mg/ml、4 mg/ml、6 mg/ml、8 mg/ml、10 mg/ml)，PTX組(2 ng/ml、4 ng/ml、6 ng/ml、8 ng/ml、10 ng/ml)，MENK聯(lián)合PTX組(2 mg/ml+2 ng/ml、4 mg/ml+4 ng/ml、6 mg/ml+6 ng/ml、8 mg/ml+8 ng/ml、10 mg/ml+10 ng/ml)，空白對(duì)照組加入RPMI1640培養(yǎng)基，細(xì)胞加入藥物作用48 h后，通過(guò)CCK-8法檢測(cè)各組抑制率，應(yīng)用中效原理評(píng)價(jià)藥物間的相互作用[7，8]。

計(jì)算公式：藥物作用效應(yīng)fa=1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值。先將中效方程fa/fu=(D/Dm)m(fa 為藥物作用效應(yīng)，即抑制率;fu=1-fa,D為藥物濃度，Dm為中效濃度，m 為斜率)兩邊取對(duì)數(shù)，得到對(duì)數(shù)方程log(fa/fu)=mlogD-mlogDm。設(shè)a=-mlogDm，b=m，x=logD，y=logfa/fu，代入后得到線性方程式y(tǒng)=bx+a。根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得fa和D值進(jìn)行線性回歸分析，計(jì)算出單用及兩藥聯(lián)合應(yīng)用時(shí)在各種效應(yīng)所需藥物的濃度D=Dm(fa/fu)1/m，最后計(jì)算兩藥聯(lián)合應(yīng)用在各種效應(yīng)時(shí)的合用指數(shù)CI=D1/DX1+D2/DX2+α(D1D2)/(DX1DX2)。D1、D2是兩藥聯(lián)合應(yīng)用時(shí)產(chǎn)生X效應(yīng)的兩藥各自所需濃度，DX1、DX2是兩藥單獨(dú)使用時(shí)產(chǎn)生X效應(yīng)的兩藥各自濃度。α=0為兩種相互排斥性藥物，α=1為兩種相互非排斥性藥物。由于MENK與PTX的作用機(jī)制不同，故本實(shí)驗(yàn)中α=0。CI<1表示兩藥合用為協(xié)同效應(yīng)，CI=1表示兩藥合用為相加效應(yīng)，CI>1表示兩藥合用為拮抗效應(yīng)。

1.2.3Hoechst33258法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按照2×104個(gè)/孔接種于24孔板中，放入孵箱培養(yǎng)。24 h后吸去培養(yǎng)基，加入相應(yīng)的藥物，各組濃度分別為MENK組(6 mg/ml)，PTX組(6 ng/ml)，MENK聯(lián)合PTX組(6 mg/ml+6 ng/ml)，空白對(duì)照組加入RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)放入孵箱培養(yǎng)。48 h后吸去培養(yǎng)基，加入0.5 ml固定液，在4℃條件下固定15 min。然后吸去固定液，用PBS洗滌2遍，每次3 min，再加入0.5 ml Hoechst33258染色液，室溫條件下避光染色10 min。最后用PBS洗滌2遍后避光風(fēng)干，加入抗熒光淬滅封片劑封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)并拍照。每組選取3個(gè)顯微鏡視野計(jì)算細(xì)胞凋亡個(gè)數(shù)，并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，接種于6孔板中，2×105個(gè)/孔。培養(yǎng)24 h后吸去培養(yǎng)基，加入相應(yīng)的藥物，分別為MENK組(6 mg/ml)，PTX組(6 ng/ml)，MENK聯(lián)合PTX組(6 mg/ml+6 ng/ml)，空白對(duì)照組加入RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)放入孵箱培養(yǎng)。48 h后吸去培養(yǎng)基，用不含EDTA的胰酶消化并收集細(xì)胞。之后用預(yù)冷的PBS清洗離心2次，每組用100 μl的Binding Buffer重懸。分別加入5 μl的Annexin V-FITC和5 μl PI試劑，輕輕混勻后，室溫避光孵育15 min。最后加入400 μl Binding Buffer至每管，細(xì)胞經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1藥物單用及兩藥聯(lián)合應(yīng)用對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，作用24 h時(shí)，與對(duì)照組相比，MENK組(6 mg/ml、10 mg/ml)、PTX組(6 ng/ml、10 ng/ml)、MENK聯(lián)合PTX組(6 mg/ml+6 ng/ml、10 mg/ml+10 ng/ml)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效果更為明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與單藥組相比，MENK聯(lián)合PTX組抑制細(xì)胞增殖的效果略強(qiáng)，但是沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。作用48 h時(shí)，與對(duì)照組相比，除2 ng/ml PTX組外，其余各實(shí)驗(yàn)組對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效果都比較明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與單藥組相比，MENK聯(lián)合PTX組(6 mg/ml+6 ng/ml、10 mg/ml+10 ng/ml)抑制細(xì)胞增殖的效果更明顯，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在加入相應(yīng)的藥物后，各實(shí)驗(yàn)組對(duì)細(xì)胞增殖均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，并且隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)和藥物作用濃度的增加，其抑制效果也越來(lái)越明顯。見圖1。

圖1 單藥組及聯(lián)合用藥組對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.1 Inhibition of proliferation of A549 cells by single drug group and combination drug group

2.2MENK聯(lián)合PTX應(yīng)用效應(yīng)的評(píng)價(jià) 通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)出各個(gè)實(shí)驗(yàn)組加入藥物作用48 h后的抑制率，繪制劑量-效應(yīng)曲線。按照中效方程，計(jì)算不同fa下的CI，并繪制fa-CI曲線(圖2)。MENK與PTX聯(lián)合使用對(duì)于A549細(xì)胞增殖的抑制作用，在整個(gè)效應(yīng)范圍中CI<1，說(shuō)明兩藥聯(lián)合應(yīng)用在整個(gè)濃度區(qū)間均產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。

圖2 MENK與PTX聯(lián)合應(yīng)用48 h的劑量-效應(yīng)曲線、fa-CI曲線Fig.2 Combination of MENK and PTX for 48 h dose-effect curve,fa-CI curve

2.3Hoechst33258染色法觀察各組細(xì)胞凋亡形態(tài)及凋亡率 Hoechst33258是一種可以透過(guò)細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，染色后，空白對(duì)照組的細(xì)胞呈均勻的淡藍(lán)色，形狀為圓形或橢圓形，比較規(guī)則。而MENK組，PTX組，MENK聯(lián)合PTX組的細(xì)胞呈現(xiàn)亮藍(lán)色，細(xì)胞核固縮、濃染、形狀不規(guī)則。根據(jù)熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)，空白對(duì)照組的凋亡率為0.8%，而MENK組、PTX組、MENK 聯(lián)合PTX組的凋亡率分別為14%、21%、34%，各給藥組的細(xì)胞凋亡率均顯著升高。與單藥組相比，MENK聯(lián)合PTX組的細(xì)胞凋亡數(shù)量最多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

圖3 熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞凋亡形態(tài)及凋亡率Fig.3 Fluorescence microscopy observation of apoptosis morphology and apoptosis rate of each group

2.4流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞加入相應(yīng)的藥物作用48 h后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，空白對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率為1.53%，而MENK 組、PTX組、MENK聯(lián)合PTX組的細(xì)胞凋亡率分別為6.23%、6.04%、13.22%。與空白對(duì)照組相比，各加藥組的細(xì)胞凋亡率均明顯升高，并且MENK聯(lián)合PTX組細(xì)胞凋亡率高于單獨(dú)用藥組。結(jié)果表明，MENK、PTX均能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而兩者聯(lián)合應(yīng)用后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用更強(qiáng)。見圖4。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率Fig.4 Flow cytometry was used to detect apoptosis rate of each group

3 討論

肺癌作為一種嚴(yán)重危害人類健康的惡性疾病，具有增殖周期短，轉(zhuǎn)移活性強(qiáng)，死亡率高的特點(diǎn)。目前臨床上針對(duì)肺癌的主要治療手段是手術(shù)切除、化療和放療[9]。然而，手術(shù)切除僅適用于被診斷為早期肺癌并且癌細(xì)胞尚未轉(zhuǎn)移到附近淋巴結(jié)外的患者，化療在肺癌的綜合治療中仍然占據(jù)著十分重要的地位。PTX是肺癌化療的首選藥物，并廣泛用于治療多種癌癥，如乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤[10]。它通過(guò)結(jié)合微管蛋白和穩(wěn)定非功能性微管束來(lái)阻斷正常的有絲分裂紡錘體發(fā)育和隨后的細(xì)胞分裂，從而表現(xiàn)出抗腫瘤活性[11]。另一方面，PTX自身的缺點(diǎn)也限制了其應(yīng)用。一個(gè)是水溶性差，傳統(tǒng)上需要Cremophor EL或Polysorbate 80等載體進(jìn)行靜脈輸送，而這些溶劑可能導(dǎo)致神經(jīng)毒性和超敏反應(yīng)；第二個(gè)缺點(diǎn)是紫杉醇具有多藥耐藥性，細(xì)胞抗性的發(fā)生限制了其功效和應(yīng)用。多藥耐藥性是暴露于一種抗癌藥物的癌細(xì)胞顯示出對(duì)各種其他抗癌藥物的抗性的機(jī)制。通過(guò)激活跨細(xì)胞蛋白從細(xì)胞中排出化學(xué)物質(zhì)，激活解毒系統(tǒng)的酶或改變基因控制細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)多藥耐藥性。

MENK最初由Hughes于1975年發(fā)現(xiàn)，是一種內(nèi)源性阿片類藥物，可調(diào)節(jié)先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，控制樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞的活化和調(diào)節(jié)功能[12]。不僅具有神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫調(diào)節(jié)活性，而且在與阿片受體結(jié)合后也具有直接的抗腫瘤活性[5]。此外，MENK還在細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞更新、傷口愈合、血管生成、腫瘤發(fā)生和腫瘤進(jìn)展中起作用。近年來(lái)的報(bào)道顯示，MENK以劑量依賴性方式，可以調(diào)節(jié)癌癥患者的免疫功能并通過(guò)結(jié)合阿片受體的方式來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)[13]。本研究團(tuán)隊(duì)之前發(fā)表的文章表明，MENK可以加強(qiáng)DC和CD4+T細(xì)胞之間的通路，通過(guò)激活CD8+T細(xì)胞，抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)，在腫瘤微環(huán)境中將M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镸1型并誘導(dǎo)DC成熟，從而增強(qiáng)特殊細(xì)胞毒性以殺死腫瘤細(xì)胞。此外，頭頸部小細(xì)胞癌、胰腺腺瘤和結(jié)腸腺瘤的腫瘤移植研究也表明，當(dāng)MENK與PTX、順鉑或吉西他濱聯(lián)合使用時(shí)，給予MENK可通過(guò)抑制細(xì)胞增殖阻止腫瘤生長(zhǎng)，并降低毒性[14]。表明MENK可以作為細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)劑，影響在致瘤狀態(tài)中表達(dá)的免疫因子。

本研究結(jié)果顯示，MENK與PTX單獨(dú)使用以及聯(lián)合應(yīng)用24 h、48 h后對(duì)A549細(xì)胞的增殖有不同程度的抑制作用，并且聯(lián)合用藥組的抑制效果要強(qiáng)于單獨(dú)用藥組。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，無(wú)論是單獨(dú)用藥組，還是MENK聯(lián)合PTX組，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的增加，其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率均有所增加，但是否具有時(shí)間依賴性和濃度依賴性還需要增加濃度梯度和時(shí)間點(diǎn)做進(jìn)一步的研究。為明確兩藥之間是否具有協(xié)同作用，設(shè)置了5個(gè)不同的濃度梯度，并通過(guò)CCK-8法測(cè)出每個(gè)濃度所對(duì)應(yīng)的藥物效應(yīng)。通過(guò)中效原理計(jì)算分析發(fā)現(xiàn)，兩藥聯(lián)用指數(shù)(CI)在濃度范圍內(nèi)均<1，兩藥間作用為協(xié)同效應(yīng)。熒光染色實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，MENK和PTX均能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且聯(lián)合用藥組的細(xì)胞凋亡率高于單獨(dú)用藥組。由此說(shuō)明，MENK可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制細(xì)胞增殖；與PTX合用后，能進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)細(xì)胞的抑制作用，不過(guò)具體機(jī)制還有待研究。

綜上所述，肺癌是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，化療期間的耐藥性是其治療中的主要障礙[15]。另外，由化療藥物所帶來(lái)的毒副作用也是臨床治療肺癌的不利因素。因此，探索藥物聯(lián)合應(yīng)用方案，發(fā)揮藥物之間的協(xié)同潛力，可以提高肺癌化療的有效性，并且降低毒性。MENK作為一種潛在的新型抗腫瘤藥物，與PTX聯(lián)合應(yīng)用，可以增強(qiáng)抗腫瘤活性，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，降低PTX的劑量，減輕它所帶來(lái)的毒副作用，為臨床化療用藥提供了一個(gè)新的思路。