miR-21通過靶向TIMP3調控黑色素瘤細胞的免疫抑制

陳 敏 郭愛元 付楚涵 竇建華 丁玉芳 黃進華

(中南大學湘雅醫(yī)學院附屬三醫(yī)院皮膚科，長沙 410013)

黑色素瘤是一種由黑素細胞過度增生引起的皮膚腫瘤，多發(fā)生于皮膚或接近皮膚的黏膜，是目前發(fā)病率增高最快的惡性腫瘤之一[1]。黑色素瘤形成及發(fā)展的過程存在免疫逃逸機制，腫瘤細胞通過分泌大量免疫抑制因子逃避機體自身免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊，導致腫瘤轉移[2,3]。黑色素瘤細胞的侵襲和遠端轉移往往導致患者預后較差。目前的治療方式仍不能達到令人滿意的效果，近期發(fā)現(xiàn)免疫治療在多種實體瘤中取得較顯著的療效，因此免疫機制的研究對于黑色素瘤的免疫治療具有重要意義。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類在進化上高度保守的內源性小分子RNA，能夠調控細胞增殖、分化、代謝和凋亡等生理病理過程[4]。近期研究發(fā)現(xiàn)miRNA在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用。miR-21與黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌等多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展、分期和預后密切相關[5-7]。研究顯示miR-21可能是黑色素瘤潛在的治療靶標，抑制其表達能夠誘導黑色素瘤細胞發(fā)生凋亡[8]。金屬蛋白酶組織抑制因子3(tissue inhibitor of metalloproteinase 3，TIMP3)是各種癌細胞中的促凋亡蛋白，被鑒定為miR-21的靶基因[9]。目前有報道顯示在乳腺癌荷瘤小鼠模型研究中，抑制腫瘤細胞中miR-21的表達，能夠促進IL-10、IL-6、轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等細胞因子的釋放，調控免疫效應，抑制荷瘤鼠腫瘤的生長[10]。在黑色素瘤細胞中miR-21是否靶向調控TIMP3參與免疫反應的研究鮮有報道，因此本實驗在細胞水平上驗證miR-21和TIMP3的靶向調控作用，并對免疫抑制因子的影響進行初步分析，以期為黑色素瘤的免疫治療提供實驗及理論依據。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對象 22例皮膚惡性黑色素瘤組織及配對癌旁組織標本收集于中南大學湘雅醫(yī)學院附屬三醫(yī)院2016年1月至2018年1月間病理科。22例黑色素瘤患者在切除手術后均經病理診斷確診，患者術前均未行放療、化療及其他形式的抗腫瘤治療。本研究經中南大學湘雅醫(yī)學院附屬三醫(yī)院倫理委員會審核并批準，患者及家屬均知情同意。所有標本收集后儲存于液氮中。

1.1.2材料與試劑 黑色素瘤細胞株SK-MEL-5、A375、WM35、SK-MEL-2(美國ATCC)；人正常表皮黑色素細胞株HeMa-Lp(上海斯信生物科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基、M-254培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司)；胰蛋白酶、胎牛血清(美國Gibco公司)；青霉素、鏈霉素(杭州四季青生物工程材料有限公司)；Lipofectamine 2000轉染試劑(美國Thermo Scientific公司)；Trizol試劑、反轉錄試劑盒(碧云天生物技術研究所)；SYBR Green Master Mix檢測試劑盒(日本TaKaRa公司)；miR-21mimic、mimic control、miR-21 inhibitor、inhibitor control(上海吉瑪制藥技術有限公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(北京原平皓生物技術有限公司)；引物及測序(上海生工生物工程股份有限公司)；BCA蛋白定量檢測試劑盒、ECL檢測試劑盒(上海浩然生物技術有限公司)；TIMP3抗體及二抗(美國Cell Signaling Technology公司)；IL-10 ELISA檢測試劑盒、TGF-β ELISA檢測試劑盒、VEGF ELISA檢測試劑盒(北京達科為生物技術有限公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 黑色素瘤細胞株SK-MEL-5、A375、WM35、SK-MEL-2培養(yǎng)在含10%胎牛血清及100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，人正常表皮黑色素細胞株HeMa-Lp培養(yǎng)在含10%胎牛血清及100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素的M-254培養(yǎng)基中，均置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據細胞生長狀態(tài)更換新鮮培養(yǎng)基，待細胞貼壁生長融合度達90%時以胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2qRT-PCR檢測組織和細胞中miR-21的表達 采用Trizol試劑分別提取皮膚惡性黑色素瘤組織、配對癌旁組織標本中以及各細胞株中總RNA。經分光光度計檢測RNA純度和濃度后，按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA。以SYBR Green Master Mix熒光定量檢測試劑盒擴增miR-21和內參。引物序列：U6引物：F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3′，R：5′-CGAATTTGCGTGTCATCCT-3′。 miR-21引物：F：5′-CCGGTTCAACATCAGTCTGATAAGCTATT-TTTTG-3′，R：5′-AATTCAAAAAATAGCTTATCAG-3′。 20 μl反應體系，反應條件為：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)，72℃延伸10 min。反應結束后統(tǒng)計每組Ct值，2-ΔΔCt法計算組織和細胞中miR-21相對表達水平。

1.2.3細胞轉染 將培養(yǎng)的A375細胞系制備細胞懸液，并轉移至24孔細胞培養(yǎng)板進行鋪板，3.0×105個/孔。置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，生長狀態(tài)良好的細胞參照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行轉染。以轉染miR-21 mimic的細胞為miR-21組，以轉染mimic control的細胞為miR-NC組，以轉染miR-21 inhibitor的細胞為anti-miR-21組，以轉染mimic control的細胞為anti-miR-NC組，以不做任何處理的細胞為Control組。轉染后的各組細胞置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。細胞轉染后24 h以qRT-PCR檢測各組細胞中miR-21的表達水平，方法同1.2.2。收集細胞培養(yǎng)上清液用于檢測IL-10、TGF-β和VEGF的含量。

1.2.4ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液中IL-10、TGF-β和VEGF的含量 收集各組細胞培養(yǎng)上清，分別按照IL-10、TGF-β、VEGF ELISA檢測試劑盒說明書操作，采用雙抗夾心ELISA法檢測上清液中IL-10、TGF-β和VEGF的含量。

1.2.5雙熒光素酶報告基因實驗 通過TagetScan生物信息學軟件進行靶向結合位點預測，發(fā)現(xiàn)miR-21與TIMP3存在結合位點。將TIMP3 3′ UTR與miR-21結合序列擴增并連接到熒光素酶報告基因載體pmirGLO上；同時將TIMP3 3′ UTR與miR-21結合序列位點突變的序列連接到熒光素酶報告基因載體pmirGLO上。將構建好的載體送測并將鑒定正確的質粒與miR-21 mimic共轉染至黑色素瘤A375細胞中，以轉染mimic control為對照。轉染24 h后收集各組細胞，以雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定Firefly熒光素酶活性和Renilla熒光素酶活性，統(tǒng)計每組相對熒光素酶活性。

1.2.6Western blot檢測細胞中TIMP3蛋白表達水平 分別收集轉染后24 h各組A375細胞及對照組細胞，加入蛋白裂解液置冰上裂解，提取各組細胞中總蛋白。經BCA蛋白定量檢測試劑盒測定所提取蛋白濃度后，將蛋白質與上樣緩沖液混合加熱至蛋白變性，取50 μg變性蛋白以SDS-GAGE進行電泳分離蛋白，電泳結束后將凝膠上的蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，然后放置于含10%脫脂奶粉的封閉液中孵育4 h，取出后加入一抗(1∶1 000)4℃過夜進行雜交，取出后洗滌，加入二抗(1∶3 000)，洗滌后以ECL化學發(fā)光，在成像系統(tǒng)中拍照，以β-actin為內參，采用Image Pro圖像分析軟件統(tǒng)計各條帶灰度值，計算各組細胞中TIMP3蛋白表達水平。

1.3統(tǒng)計學分析 所得實驗數據以統(tǒng)計學軟件SPSS21.0分析，以單因素方差分析比較多組差異，以SNK-q檢驗比較組間差異，每組數據代表3個生物學重復，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1miR-21在黑色素瘤組織和細胞中低表達 采用qRT-PCR檢測黑色素瘤組織及對應癌旁組織中miR-21的表達水平，結果如圖1A所示，與癌旁組織比，黑色素瘤組織中miR-21的表達水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。檢測不同黑色素瘤細胞株及正常表皮黑色素細胞株中miR-21的表達水平，結果如圖1B所示，與正常表皮黑色素細胞相比，黑色素瘤細胞SK-MEL-5、A375、WM35、SK-MEL-2中miR-21的表達水平均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。鑒于miR-21在不同黑色素瘤細胞株的表達水平，選擇黑色素瘤細胞A375用于后續(xù)實驗。

圖1 不同組織和細胞中miR-21表達水平Fig.1 Expression levels of miRNA-21 in different tissues and cells

2.2轉染miR-21 mimic對細胞因子IL-10、TGF-β和VEGF含量的影響 qRT-PCR檢測結果顯示，與miR-NC相比，miR-21組細胞中miR-21的表達水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2A)。ELISA檢測結果顯示，與miR-NC相比，miR-21組上清中IL-10、TGF-β和VEGF含量均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2B～D)。

圖2 轉染miR-21 mimic對細胞中miR-21表達及上清中IL-10、TGF-β和VEGF含量的影響Fig.2 Effects of miR-21 mimic transfection on expression of miR-21 in cells and contents of IL-10,TGF-β and VEGF in supernatant

2.3轉染miR-21 inhibitor對細胞因子IL-10、TGF-β和VEGF含量的影響 qRT-PCR檢測結果顯示，與anti-miR-NC相比，anti-miR-21組細胞中miR-21的表達水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3A)。ELISA檢測結果顯示，與miR-NC相比，miR-21組上清液中IL-10、TGF-β和VEGF的含量均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3B～D)。

圖3 轉染miR-21 inhibitor對細胞中miR-21的表達及上清中IL-10、TGF-β和VEGF的含量的影響Fig.3 Effects of miR-21 inhibitor transfections on expression of miR-21 in cells and contents of IL-10,TGF-β and VEGF in supernatants

2.4TIMP3是miR-21的靶基因 生物信息學軟件TagetScan預測miR-21與TIMP3靶向結合位點，如圖4A所示，miR-21能夠與TIMP3 3′UTR靶向結合。雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-21和TIMP3靶向結合關系，如圖4B所示，與mimic control和TIMP3 3′UTR野生型共轉染組相比，miR-21 mimic組和TIMP3 3′UTR野生型共轉染組相對熒光素酶活性顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與mimic contro組和TIMP3 3′UTR突變型共轉染組相比，miR-21 mimic組和TIMP3 3′UTR突變型共轉染組相對熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。以上實驗說明TIMP3是miR-21的靶基因。

圖4 TIMP3和miR-21靶向結合關系驗證Fig.4 Validation of target-binding relationship between TIMP3 and miR-21

2.5miR-21靶向調控TIMP3的表達 Western blot檢測結果顯示，與miR-NC相比，miR-21細胞中TIMP3蛋白表達水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖5A)。與anti-miR-NC相比，anti-miR-21組細胞中TIMP3蛋白表達水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖5B)。

圖5 轉染miR-21 mimic及inhibitor后細胞中TIMP3蛋白表達水平Fig.5 Expression of TIMP3 protein in cells transfected with miR-21 mimic and inhibitor

3 討論

黑色素瘤是皮膚常見惡性腫瘤，術后復發(fā)率高，且預后效果較差，死亡率較高。近年來免疫治療在癌癥治療中取得了突飛猛進的進展，讓越來越多的學者看到了免疫治療的前景。免疫治療在黑色素瘤的綜合治療中發(fā)揮重要作用，但腫瘤免疫逃逸大大影響了免疫治療的效果[11]。因此對腫瘤免疫逃逸機制的研究在腫瘤免疫治療中顯得尤為重要。參與腫瘤免疫逃逸的免疫抑制分子包括IL-10、TGF-β1等，這些免疫抑制分子參與腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視及細胞轉型，為腫瘤細胞發(fā)生轉移和增殖提供有利條件[12-14]。IL-10具有抑制巨噬細胞及自然殺傷細胞增殖的功能，在腫瘤免疫中發(fā)揮主要作用[15]。TGF-β1能夠抑制T細胞的增殖、分化及活化，促進腫瘤細胞生長[16]。VEGF參與腫瘤血管發(fā)生及機體免疫調節(jié)過程，影響細胞毒性T細胞生物殺傷效應[17]。IL-10、TGF-β1和VEGF等細胞因子水平的增高能夠抑制免疫反應，逃避免疫監(jiān)視，促進腫瘤發(fā)展和轉移[18]。因此通過對腫瘤的免疫逃逸機制的研究能夠更清楚地了解腫瘤發(fā)生和發(fā)展的過程，可從提高機體免疫能力，逆轉腫瘤免疫逃逸等多角度為黑色素瘤的免疫治療提供新思路。

本實驗通過檢測黑色素瘤患者組織和不同黑色素瘤細胞株中miR-21的表達水平，發(fā)現(xiàn)miR-21在黑素色瘤組織和細胞中均呈低表達。通過在黑色素瘤A375細胞中轉染miR-21 mimic，上調A375細胞中miR-21的表達，經ELISA檢測發(fā)現(xiàn)IL-10、TGF-β1和VEGF的含量顯著升高；下調A375細胞中miR-21的表達能夠抑制細胞因子IL-10、TGF-β1和VEGF的分泌。表明miR-21能夠下調細胞因子IL-10、TGF-β1和VEGF的表達。與Chen等[19]關于丙型肝炎病毒感染上調miR-21的表達，靶向TLR信號通路的效應因子，參與逃避宿主免疫系統(tǒng)監(jiān)視的研究相符。He等[20]的研究同樣顯示miR-21能夠介導免疫應答，且能夠影響小鼠移植瘤的生長。miR-21在免疫應答和炎癥性疾病中起重要作用，且可通過抑制NF-κB信號通路促進淋巴細胞的增殖，在自身免疫性淋巴組織增生綜合征中發(fā)揮重要作用[21-23]。此外本實驗通過生物學軟件預測及雙熒光素酶報告基因實驗驗證了miR-21和TIMP3靶向結合關系，通過Western blot檢測上調或下調miR-21的表達對A375細胞中TIMP3蛋白表達的影響，顯示miR-21能夠負向調控TIMP3的表達。與Nagao[24]和Gutsaeva等[25]miR-21能夠靶向調控TIMP3的研究一致。綜合以上實驗，miR-21通過靶向抑制TIMP3表達影響細胞因子IL-10、TGF-β1和VEGF的分泌參與黑色素瘤免疫逃逸。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)miR-21靶向負調控TIMP3的表達調控黑色素瘤免疫逃逸，其作用機制可能與調控黑色素瘤細胞分泌的細胞因子IL-10、TGF-β1和VEGF的含量有關。下調細胞中miR-21的表達，提高相關免疫抑制分子的分泌，有效逆轉腫瘤的免疫逃逸，為黑色素瘤的免疫治療提供候選作用靶點。