IMP3基因沉默介導Notch信號通路對結直腸癌上皮間質轉化及血管生成的影響①

肖忠盛 龍 泓 丁成明 肖友忠 劉麗兵

(南華大學附屬第一醫(yī)院 胃腸外科，衡陽 421001)

結直腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，具有發(fā)病隱匿、預后較差的特點，對患者的生命健康造成嚴重威脅[1]。上皮-間質轉化(epithelialmesen-chymal transition,EMT)是生物體內上皮細胞向間質細胞表型轉化的一種生物學過程，已證實與多種惡性腫瘤的侵襲轉移相關[2]。除EMT外，惡性腫瘤非可控的血管新生能力同樣是影響腫瘤生長及侵襲轉移的重要因素[3]。胰島素樣生長因子Ⅱ mRNA結合蛋白3(insulin-like growth factor Ⅱ mRNA binding protein 3,IMP3)是人體內高度保守的mRNA結合蛋白[4]。既往研究證實其在乳腺癌、胃癌等多種腫瘤的進展中扮演重要角色[5,6]。但對于其具體機制及是否通過Notch信號通路等下游通路影響腫瘤尚未完全明確。Notch信號通路是一種能夠對腫瘤細胞增殖、凋亡及周期調控等造成重要影響的通路，高表達的Notch通常促進胃癌及結腸癌等腫瘤的形成[7]。本研究在前人研究的基礎上，進一步探討IMP3是否通過Notch信號通路影響結直腸癌的EMT以及血管生成，以期為結直腸癌的治療進一步提供依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑及設備 IMP3 shRNA序列及陰性對照序列由華大基因合成；lipofectamin 2000試劑盒購自賽默飛世爾；Notch通路抑制劑BMS-708163購自MedChemExpress有限公司； RIPA裂解液和BCA試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；Western blot中抗體均購自Abcam；MTT試劑盒購自Sigma-Aldrich；Transwell小室和Matrigel膠購自上海前塵生物科技有限公司；光學顯微鏡和酶聯(lián)免疫檢測儀購自Molecular Device。

1.1.2研究對象 收集2017年1月～2018年2月于我院確診的73例結直腸癌患者腫瘤切除術后的新鮮結直腸癌組織及癌旁組織(距病灶5 cm)?；颊吣挲g36～82歲，平均 (59.11±6.60) 歲。依據國際抗癌聯(lián)盟2010年標準對患者進行TNM分期[8]：Ⅰ期33例、Ⅱ期40例。受試者均遵照以下納排標準[9]：經過臨床、影像、病例確診的結直腸癌瘤；診斷時未發(fā)生轉移；經過標準診療程序；所有病例術前均未經放療、化療。排除標準：繼發(fā)性病灶；未按照規(guī)范程序診療；其他惡性腫瘤病史。所有瘤組織及癌旁組織樣本均切成小塊后迅速置于凍存管中以液氮保存。本研究經我院臨床實驗倫理委員會同意，所有患者簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1免疫組化半定量檢測癌癥及癌旁組織中IMP3蛋白表達 10%的甲醛固定組織，烤片，脫蠟，梯度酒精脫水。用pH=6.0的檸檬酸鈉微波修復，加熱沸騰20 min，自然冷卻，PBS洗滌5 min×3次。3%的H2O2阻斷內源性過氧化物酶15 min，PBS沖洗后擦干，滴加5% BSA封閉液并于37℃孵育30 min。滴加人IMP3一抗4℃孵育過夜，PBS溶液洗滌5 min×3次。滴加生物素化的二抗山羊抗兔IgG于37℃孵育30 min后PBS沖洗5 min×3次。滴加辣根過氧化物酶標記的卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次。DAB/H2O2反應染色，自來水沖洗，蘇木素復染，常規(guī)脫水透明后封片。觀察IMP3陽性表達的定位及IMP3陽性表達百分比，陰性細胞核為藍色或淺藍色，陽性細胞漿為棕黃色或強棕黃色，每張切片隨機選取5個高倍視野 (400×)，每個視野數100個細胞，按陽性細胞所占百分比評分[10]。

1.2.2細胞分組及處理 將購買的結腸癌細胞株SW620培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，以1×105個/孔的密度接種于6孔板，置于37℃、5%CO2及飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。待細胞鋪滿培養(yǎng)板80%～90%時，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。將SW620細胞分為空白組(不作任何處理)、陰性對照組(轉染含IMP3 shRNA陰性對照序列的脂質體+lipofectamin 2000)、IMP3 shRNA組(轉染含IMP3 shRNA序列脂質體+lipofectamin 2000)、通路抑制劑組(Notch通路抑制劑BMS-708163處理)、聯(lián)合組(IMP3 shRNA聯(lián)合BMS-708163共同處理)。

1.2.3Western blot檢測各組細胞EMT和血管生成相關因子表達 RIPA裂解液溶于PMSF使其終濃度為1 mmol/L，取250 μl裂解液至離心管中裂解各組SW620細胞5 min后于4℃，12 000 r/min離心10 min，取上清，稀釋后以BCA試劑盒測定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結束后轉膜并用含5%BSA的TBST在脫色搖床上室溫封閉1 h。棄封閉液，加入一抗Notch1、Hes1、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、VEGF、TNF-α或TGF-β，4℃孵育過夜。TBST漂洗10 min×3次。加入HRP(辣根過氧化物酶)標記的二抗IgG于室溫搖床孵育2 h。TBST漂洗5 min×3次，ECL顯色，X片曝光，照相。使用E-Gel Imagergel documentation system分析顯色條帶吸光度。以樣本的平均吸光度除以相應內參照的平均吸光度即為樣本蛋白的相對含量，將各樣本蛋白的相對含量間做統(tǒng)計分析圖。

1.2.4四唑鹽(MTT)比色法檢測各組細胞活力 SW620細胞處理48 h后，0.25%胰酶消化30 s，調整細胞密度為1×104個/孔接種到96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)24～72 h。隨后每個培養(yǎng)孔中加入MTT溶液20 μl(5 mg/ml)放于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h，棄上清。每孔中加入DMSO 150 μl，震蕩使結晶溶解并混勻。用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處測量各孔吸光值，以空白培養(yǎng)基調零，取各組平行孔的平均OD值，繪制各組細胞的生長曲線。

1.2.5Transwell檢測各組細胞侵襲能力 用預冷的無血清DMEM培養(yǎng)基以1∶10 稀釋Matrigel后，各上室加入100 μl，室溫放置2 h；將上述各組處理48 h 的SW620細胞消化后用無血清DMEM 培養(yǎng)基重懸，計數并稀釋至3×105個/ml，取100 μl 加入Transwell上室，下室中加入600 μl含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，按照Transwell小室說明書操作，用結晶紫染色，光鏡下隨機選取3個視野并計數跨膜的細胞數并計算細胞侵襲率。侵襲率=穿過基質膠的細胞數/總細胞數×100%。

2 結果

2.1IMP3在癌組織中高表達 免疫組化結果表明，IMP3在組織各處都有表達。與癌旁組織 (38.7%) 相比，癌組織 (78.4%) 中IMP3蛋白表達顯著升高(P<0.05)，見圖1。

圖1 IMP3蛋白在結直腸癌及癌旁組織中的表達(×200)

2.2IMP3沉默介導Notch通路抑制SW620細胞上皮間質轉化 Western blot結果表明，相較于陰性對照組，IMP3 shRNA組、通路抑制劑組和聯(lián)合組中Notch1及Hes1表達顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，聯(lián)合組抑制效果更明顯，與IMP3shRNA組、通路抑制劑組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與陰性對照組相比，IMP3 shRNA組、通路抑制劑組和聯(lián)合組N-cadherin和Vimentin蛋白水平顯著降低，但E-cadherin在上述組中表達顯著升高(P<0.05)。聯(lián)合組N-cadherin和Vimentin指標變化更明顯，與shRNA組和抑制劑組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)?？瞻捉M與陰性對照組各指標均無顯著差異(P>0.05)，見圖2。

圖2 各組細胞Vimentin、E-cadherin和N-cadherin蛋白表達情況Fig.2 Vimentin,E-cadherin and N-cadherin protein expression in each groupNote:A.Expression of Vimentin,E-cadherin and N-cadherin was determined by western blot.B.Quantification of protein expression.Compared with Negative control group,#.P<0.05;compared with combined treatment group,*.P<0.05.

2.3IMP3沉默介導Notch通路抑制SW620細胞血管生成相關因子表達 與陰性對照組相比，IMP3 shRNA組、通路抑制劑組和聯(lián)合組VEGF、TNF-α和TGF-β蛋白水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；空白組上述三種因子表達均無顯著差異(P>0.05)。聯(lián)合組效果對上述蛋白的抑制效果更明顯，與shRNA組和抑制劑組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 各組細胞VEGF、TNF-α和TGF-β蛋白表達情況Fig.3 VEGF,TNF-α and TGF-β protein expression in each groupNote:A.Expression of VEGF,TNF-α and TGF-β was determined by western blot.B.Quantification of protein expression.Compared with Negative control group,#.P<0.05;compared with combined treatment group,*.P<0.05.

2.4IMP3沉默介導Notch通路抑制SW620細胞活力 與陰性對照組相比，IMP3 shRNA組、通路抑制劑組和聯(lián)合組細胞活力在24 h、48 h及72 h均顯著降低(P<0.05)；空白組在上述時間點均無顯著差異(P>0.05)。聯(lián)合組細胞活力降低更為明顯，與shRNA組和通路抑制劑組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 MTT檢測各組細胞活力

2.5IMP3沉默介導Notch通路減弱SW620細胞侵襲能力 與陰性對照組相比，IMP3 shRNA組、通路抑制劑組和聯(lián)合組穿膠細胞數均顯著增多(P<0.05)；空白組無顯著差異(P>0.05)。聯(lián)合組細胞侵襲受到更顯著的抑制，與shRNA組和通路抑制劑組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 Transwell法檢測各組細胞侵襲能力(×400)

3 討論

越來越多的研究證實，多種惡性腫瘤中均可見EMT的發(fā)生，出現(xiàn)EMT的患者對放化療不敏感，對分子靶向藥物的耐藥性也逐漸增強，EMT則是患者對此類藥物產生耐藥的關鍵因素之一[11]。非可控的血管新生能力作為惡性腫瘤的重要特征，也是引起腫瘤生長和侵襲轉移的重要因素[12]。本研究從結直腸癌EMT及血管生成的分子調控機制出發(fā)，證實了IMP3基因介導Notch信號通路在結直腸癌中的調控機制。

本研究對切除的結直腸癌組織和癌旁組織行HE染色發(fā)現(xiàn)，相對于癌旁組織，結直腸癌腺體組織結構紊亂，且血管生成和炎癥細胞浸潤明顯。IMP3基因是胰島素樣生長因子mRNA結合蛋白家族(IMPs)的 成員之一，Riener等[13]在研究中發(fā)現(xiàn)，IMP3在頭頸部鱗狀細胞癌中表達顯著增強，且其表達程度與癌患者的臨床分期、淋巴結轉移及遠處轉移等存在關聯(lián)。Wei等[14]也發(fā)現(xiàn)，IMP3表達增強可能是結腸癌進展過程中的早期事件，也是促進結腸癌細胞增殖的重要原因。本研究通過免疫組化檢測IMP3在結直腸癌和癌旁組織中的表達，發(fā)現(xiàn)IMP3在癌組織(78.4%)中表達顯著高于其在癌旁組織(38.7%)中表達。進一步證實了IMP3在結直腸癌進展中扮演重要角色。

Notch信號通路廣泛存在于生物體內，對細胞的生長、發(fā)育、凋亡、分化等起重要的調控作用[15]。Notch信號通路與多種腫瘤的發(fā)生密切相關，越來越多的研究證實結直腸癌患者體內Notch信號通路被顯著激活[16]。Hes1是Notch的靶基因，同時也是腫瘤干細胞的重要標記物。在腫瘤組織中，Hes1高表達會導致腫瘤細胞過度增殖，而阻斷其表達則會加速誘導腫瘤細胞的凋亡和分化[17]。Notch1作為Notch通路的主要受體，在細胞的增殖凋亡調控中發(fā)揮重要作用。Notch1高表達可加速未分化細胞的惡化，在結直腸癌進展中發(fā)揮促癌作用[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，Notch1以及Hes1在結腸癌細胞中表達顯著增強，沉默IMP3基因后，其表達被抑制，提示IMP3基因沉默在抑制Notch信號通路表達中發(fā)揮重要作用。腫瘤在進展過程中，其細胞能夠與周圍間質相互作用，上皮細胞逐漸轉化為間質細胞，具體表現(xiàn)為上皮細胞標志物E-cadherin表達的減弱以及間質細胞標志物Vimentin和N-cadherin表達的增強，這種現(xiàn)象也被稱為EMT，是導致腫瘤侵襲轉移的重要原因[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，相對于陰性對照組，IMP3 shRNA組及Notch通路抑制組的Vimentin和N-cadherin表達降低，而E-cadherin表達升高，聯(lián)合組變化更明顯，進一步提示了IMP3基因沉默能夠抑制Notch信號通路進而抑制SW620細胞EMT的發(fā)生。血管生成是腫瘤細胞增殖、侵襲以及疾病進展的重要因素。TNF-α作為人體內關鍵促炎因子，能夠激活多種血管生成相關因子進而引起缺血、腫瘤血管生成增加[20]。VEGF和TGF-β是常見的促血管生成因子，與多種腫瘤的血管生成有關，同時也可作為癌癥浸潤轉移等生物學行為的重要評估指標[21]。本研究測量處理后細胞的血管生成相關因子發(fā)現(xiàn)，IMP3基因沉默或抑制Notch信號通路能夠抑制TNF-α、VEGF和TGF-β的表達，且聯(lián)合組抑制程度更明顯，提示IMP3基因沉默介導Notch信號通路在抑制結直腸癌血管生成中具有重要作用。MTT以及Transwell實驗進一步檢測各組細胞活力及細胞侵襲能力，發(fā)現(xiàn)IMP3沉默或抑制Notch通路表達后，SW620細胞的細胞活力及侵襲率均顯著降低，且聯(lián)合組更明顯，進一步說明了IMP3基因沉默能夠介導Notch信號通路發(fā)揮對SW620細胞活力和侵襲能力的抑制作用。

綜上所述，IMP3基因沉默能夠抑制Notch通路活化進而抑制結直腸癌EMT及血管生成，在結直腸癌的進展中具有保護作用。IMP3以及Notch通路聯(lián)合處理能夠在結直腸癌的治療中發(fā)揮更好的效果。對于IMP3介導Notch通路是否受上游miRNA的調控仍需進一步實驗證實。