LncRNA MALAT-1對彌漫性大B細胞淋巴瘤增殖和耐藥性的影響①

農(nóng)衛(wèi)霞 王 奎 龍珍珠瑪 王新華 王 燕

(新疆石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院血液風濕科，石河子 832000)

淋巴瘤是一類起源于淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，主要分為霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。彌漫性大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤中最常見的類型，隨著醫(yī)療水平的發(fā)展，DLBCL患者的5年生存率和預后得到了顯著提升，但仍有約30%的患者死于復發(fā)或耐藥，因此深入闡明DLBCL的發(fā)病機制對其臨床治療具有重要意義[1,2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 bp 的非編碼RNA，主要從表觀遺傳、染色體重塑、轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后等不同水平上調(diào)控基因的表達，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[3,4]。肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(metastasis-associated lung adenocarci-noma transcript 1,MALAT-1)是在非小細胞肺癌患者中發(fā)現(xiàn)的首個與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的LncRNA，近來研究顯示MALAT-1在乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌等多種腫瘤中呈異常表達，并影響腫瘤的發(fā)展和預后[5,6]。本研究旨在探討LncRNA MALAT-1對DLBCL增殖和耐藥性的影響。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 收集2015年3月至2018年11月我院收治的DLBCL患者的淋巴組織標本81例，其中男性50例，女性31例；年齡19～83歲，平均年齡(52.1±6.6)歲。根據(jù)Ann Arbor分期標準分為：Ⅰ期15例，Ⅱ期22例，Ⅲ期27例，Ⅳ期17例；有B癥狀(不能解釋的發(fā)熱>38℃；盜汗；皮膚瘙癢；體質(zhì)量減輕等)29例，無B癥狀52例；根據(jù)非霍奇金淋巴瘤國際預后指數(shù)(IPI)評分標準：0～1分19例，2分26例，3～5分36例；乳酸脫氫酶(LDH)>300 U/L 43例，<300 U/L 38例。納入標準：①所有患者經(jīng)組織病理學確診為DLBCL；②所有患者術(shù)前均未接受任何放、化療治療；③所有患者病歷資料完整并簽署知情協(xié)議書；④排除合并心肝腎等重大器官疾病及其他惡性腫瘤患者。另選取60例經(jīng)病理檢測確診為非DLBCL患者的健康淋巴組織作為對照組。

1.1.2試劑 DLBCL細胞系OCI-Ly8購自南京科佰生物科技有限公司。RNAprep pure動物組織總RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix EX Taq熒光定量試劑均購自日本TaKaRa公司。Cell Counting Kit-8細胞增殖試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。阿霉素(Doxorubicin)購自北京索萊寶科技有限公司。MDR1和MRP1兔多克隆抗體購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1實時熒光定量PCR 采用組織RNA提取試劑盒分離DLBCL組織和正常淋巴組織中的總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)NCBI中查詢到的人MALAT-1核酸序列設計RT-PCR引物為：MALAT-1-F：5′-GGTCTCTGTGTCTTCGGAG-3′，MALAT-1-R：5′-GGAAAACGCCTCAAT-CCCAC-3′。同時取人GAPDH基因作為內(nèi)參，GAPDH-F：5′-CACTGCCAACGTGTCAGTG-3′，GAPDH-R：5′-GAC-AAAGTGGTCGTTGAGGG-3′。根據(jù)RT-PCR試劑盒說明書配置反應體系，設置RT-PCR反應程序為：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。反應結(jié)束后采用2-ΔΔCt法計算MALAT-1 mRNA的相對表達含量。

1.2.2慢病毒穩(wěn)定細胞系構(gòu)建 pGLVH1-GFP-MALAT-1-shRNA和pGLVH1-GFP-NC-shRNA慢病毒干擾載體由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建。分別將MALAT-1-shRNA或NC-shRNA慢病毒表達載體與包裝質(zhì)粒Helper vector-Ⅰ、Helper vector-Ⅱ、Helper vector-Ⅲ共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，轉(zhuǎn)染6 h后換液，48 h后離心取上清，0.45 μm過濾器過濾，將病毒上清分別加入至指數(shù)生長期的DLBCL細胞系OCI-Ly8中培養(yǎng)。48 h后換液并加入1 μg/ml的嘌呤霉素(根據(jù)細胞死亡情況調(diào)整給藥濃度)，直至熒光顯微鏡下所有細胞均表達綠色熒光時表明細胞系構(gòu)建成功。

1.2.3CCK-8法檢測細胞增殖 MALAT-1-shRNA組、NC-shRNA組OCI-Ly8細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，胰酶消化，重懸，計數(shù)，取100 μl(5×104個細胞)接種到96孔板內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。分別于第24 h、36 h、48 h和72 h向各組細胞加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h。不同細胞在各時間點均設置3個復孔。酶標儀450 nm處檢測各孔吸光度值。

1.2.4細胞耐藥性檢測 MALAT-1-shRNA組、NC-shRNA組OCI-Ly8細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，胰酶消化，重懸，計數(shù)，取100 μl(1×105個細胞)接種到96孔板內(nèi)，每組細胞設置3個復孔。細胞貼壁后更換培養(yǎng)基，NC-shRNA組和MALAT-1-shRNA組細胞分別加入200 ng/ml的阿霉素，另取一組NC-shRNA細胞加入等體積的PBS作為對照組。避光培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h孔內(nèi)加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h。酶標儀450 nm處檢測各孔吸光度值，根據(jù)吸光度值計算各組細胞存活率。

1.2.5Western blot實驗 MALAT-1-shRNA組和NC-shRNA組OCI-Ly8細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取2 ml(1×106個細胞)接種到6孔板內(nèi)，每組細胞設置3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細胞，加入RIPA裂解液在冰上裂解30 min，12 000 g離心20 min，取上清。SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入MDR1(1∶2 000稀釋)和MRP1(1∶1 000稀釋)抗體，4℃孵育過夜。PBST洗滌3次，羊抗兔二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育2 h，PBST洗滌3次，ECL發(fā)光液顯影。

2 結(jié)果

2.1MALAT-1在DLBCL組織和健康淋巴組織中的表達 健康淋巴組織和DLBCL組織中LncRNA MALAT-1的mRNA相對表達水平分別為0.41±0.08和1.46±0.11，LncRNA MALAT-1在DLBCL組織中的相對表達水平顯著高于健康淋巴組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 DLBCL組織和健康淋巴組織中LncRNA MALAT-1 的相對表達水平Fig.1 Relative expression level of LncRNA MALAT-1 in DLBCL and healthy lymphoid tissueNote:*.P<0.05.

2.2LncRNA MALAT-1下調(diào)對DLBCL細胞增殖的影響 CCK-8檢測顯示，與NC-shRNA組相比，MALAT-1-shRNA組細胞在24 h、36 h、48 h以及72 h 的增殖能力均顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 MALAT-1對DLBCL細胞增殖能力的影響Fig.2 Effect of MALAT-1 on proliferation of DLBCL cellsNote:Compared with NC-shRNA,*.P<0.05.

2.3MALAT-1下調(diào)對DLBCL細胞耐藥性的影響 加入Adriamycin的細胞增殖結(jié)果顯示，NC-shRNA組、MALAT-1-shRNA組、NC-shRNA+Adri-amycin組和MALAT-1-shRNA+Adriamycin組曲線的平均斜率分別為0.46±0.07、0.27±0.09、0.29±0.08和0.11±0.04。與NC-shRNA組比較，MALAT-1-shRNA組增殖曲線的平均斜率下降；與NC-shRNA組、MALAT-1-shRNA組和NC-shRNA+Adriamycin組比較，MALAT-1-shRNA+Adriamycin組增殖曲線的平均斜率下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 MALAT-1下調(diào)對DLBCL細胞耐藥性的影響Fig.3 Effect of down-regulation of MALAT-1 on retina of DLBCL cellsNote:Compared with MALAT-1-shRNA+Adriamycin,*.P<0.05.

2.4MALAT-1下調(diào)對相關(guān)耐藥基因表達的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示，與NC-shRNA組MDR1和MRP1的蛋白表達水平1.10±0.21、1.34±0.18比較，MALAT-1-shRNA組細胞中MDR1和MRP1的蛋白表達水平0.45±0.12、0.78±0.17顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 MALAT-1對相關(guān)耐藥基因MDR1和MRP1表達的影響Fig.4 Effect of MALAT-1 on expression of MDR1 and MRP-1

3 討論

MALAT-1是一種定位于人類染色體11q13.1，全長約8 000 bp的LncRNA，在哺乳動物中高度保守，并且具有明顯的器官表達差異性和時間表達差異性[7]。作為LncRNA家族中重要的一員，MALAT-1已被證明在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳、細胞周期調(diào)控、炎癥反應以及腫瘤轉(zhuǎn)移等機制中發(fā)揮著不同的作用[8,9]。研究顯示，MALAT-1在多種腫瘤組織中的表達量顯著高于正常組織，并與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。如MALAT-1在非小細胞肺癌組織中表達增加，對有可能發(fā)生轉(zhuǎn)移的高風險早期非小細胞肺癌患者的臨床診斷具有重要意義[10]；Yao等[11]的研究顯示MALAT-1在食管癌組織中高表達，并且與患者預后相關(guān)，敲低MALAT-1可顯著抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲[11]；Gao等[12]的研究則表明MALAT-1通過上調(diào)HMGB1的表達從而促進多發(fā)性骨髓瘤細胞的自噬，并抑制腫瘤細胞的凋亡。本研究結(jié)果顯示，與健康淋巴組織相比，DLBCL組織中MALAT-1的mRNA相對表達水平顯著增加，提示MALAT-1可能在DLBCL的發(fā)生及進展中扮演重要角色。

為了進一步探究MALAT-1在DLBCL中可能的作用途徑，本研究構(gòu)建了MALAT-1-shRNA慢病毒穩(wěn)定細胞系，隨后用CCK-8法檢測MALAT-1敲低后對DLBCL細胞增殖和耐藥性的影響。結(jié)果顯示，人為降低MALAT-1的表達后，DLBCL細胞的增殖能力受到顯著抑制。耐藥實驗則顯示，DLBCL一線化療藥物阿霉素處理細胞后，MALAT-1-shRNA組細胞在各時間點的增殖活力均顯著低于NC-shRNA組，提示沉默MALAT-1的表達可大幅提高阿霉素的殺傷效果，降低DLBCL細胞對阿霉素化療的抵抗效應。

阿霉素主要通過嵌入腫瘤細胞的DNA堿基，阻礙DNA的轉(zhuǎn)錄和RNA的合成，從而促進細胞的凋亡、自噬或壞死，但阿霉素的長期使用也會使腫瘤細胞對其產(chǎn)生耐藥性[13]。部分ABC轉(zhuǎn)運蛋白介導的多藥耐藥(mutiple drug resistance，MDR)是腫瘤細胞耐藥機制中的重要途徑[14]。ABC家族的主要成員如多藥耐藥基因1(multi-drug resistance gene 1,MDR1)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(multi-drug resistance-associated protein,MRP1)、乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)等均在阿霉素誘導的腫瘤細胞耐藥中起關(guān)鍵作用[15,16]。研究顯示MDR1、MRP1和BCRP蛋白在白血病、乳腺癌、肺癌以及DLBCL等多種惡性腫瘤中存在原發(fā)性高表達，并與患者的化療效果和預后密切相關(guān)[17,18]。本研究發(fā)現(xiàn)，與NC-shRNA組比較，MALAT-1-shRNA組細胞中MDR1和MRP1的蛋白表達水平顯著下調(diào)，提示MALAT-1的下調(diào)可顯著抑制DLBCL細胞中MDR1和MRP1的表達，MALAT-1參與DLBCL中MDR1和MRP1介導的耐藥調(diào)控。

綜上所述，MALAT-1在DLBCL組織高表達，沉默MALAT-1可顯著抑制DLBCL腫瘤細胞的增殖和耐藥性，有望為DLBCL的早期診斷、臨床化療以及預后評估提供重要的參考。