結(jié)核分枝桿菌Hsp60影響小鼠巨噬細(xì)胞抗原提呈相關(guān)分子表達(dá)的研究①

李 茂 張焱皓 黃 波 李娜娜 羅軍敏 鄢仁晴

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,遵義醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，遵義 563000)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(mycobacte-rium tuberculosis complex，MTB)引起的慢性感染性疾病。2018年WHO估算全球范圍內(nèi)新發(fā)結(jié)核病例達(dá)1 010萬，我國新發(fā)病例為93萬，發(fā)病率位居全球第三[1]。開展結(jié)核桿菌致病機理的研究及有效控制結(jié)核病的散發(fā)及流行意義重大。結(jié)核分枝桿菌感染的清除由機體的固有免疫和適應(yīng)性免疫共同介導(dǎo)，固有免疫由位于抗原提呈細(xì)胞表面或胞漿的模式識別受體激活，其激活的抗原提呈作用和細(xì)胞因子的分泌作用為誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答所必需[2]。熱休克蛋白60(heat shock protein 60，Hsp60)可作為危險信號誘發(fā)機體的免疫應(yīng)答，這與抗原的提呈、淋巴細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的活化有關(guān)[3]。Panayi等[4]發(fā)現(xiàn)被結(jié)核分枝桿菌感染后Hsp60在宿主巨噬細(xì)胞中表達(dá)量增加，過量的Hsp60可能會干擾結(jié)核感染者巨噬細(xì)胞的抗原提呈及相關(guān)分子的表達(dá)。

本實驗采用MTB Hsp60刺激小鼠骨髓巨噬細(xì)胞，然后檢測MHCⅡ類分子，以了解其對小鼠骨髓巨噬細(xì)胞抗原提呈相關(guān)分子表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 20只SPF級健康雌性BALB/c小鼠，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)證號：SCXK(湘)2014-0011,周齡6～8周，體質(zhì)量16～20 g，所有小鼠飼養(yǎng)于22～26℃，相對濕度40%～80%，明暗交替12 h的環(huán)境中，潔凈飲水和標(biāo)準(zhǔn)飼料自由飲食，倫理聲明：所有動物及實驗依照Animal Care and Use of Laboratory Animals(Ministry of Health，China，1998)的指導(dǎo)進(jìn)行，并通過本校實驗動物和使用倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2實驗試劑 GM-CSF購自NOVUS公司，PCR相關(guān)試劑購自TaKaRa公司,DMEM低糖培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清購自MRC公司。MTB Hsp60序列由北京六合華大基因科技有限公司提供，合成1 620 bp的Hsp60基因片段，連接到pE/T28a載體上，然后用大腸桿菌BL/21菌株表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白。配制濃度分別為：50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml。FITC標(biāo)記的F4/80、PE標(biāo)記的MHCⅡ、PECY5標(biāo)記的CD86以及相同熒光標(biāo)記的同型對照均購自美國BD公司。

1.1.3實驗儀器 C1000TMThermal cycler熒光定量PCR儀，S1000TMThermal cycler PCR儀，GelDocXR+凝膠成像分析系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品，Carestream 4000MM PRO為加拿大Carestream Health公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀FACScan為BD公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1小鼠骨髓巨噬細(xì)胞培養(yǎng) 取6～8周齡BALB/c小鼠，脫頸處死并開放髓腔，用DMEM完全培養(yǎng)基沖洗骨髓腔至骨質(zhì)透白，沖洗液即細(xì)胞懸液，將沖洗液粗過濾、離心、裂解、洗滌、重懸，即得到小鼠骨髓來源單細(xì)胞懸液；加入10% FBS的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個/ml，鋪于6孔板中，加入20 ng/ml GM-CSF，置于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)；培養(yǎng)至第3天時，用2 ml含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基和 GM-CSF培養(yǎng)液換液；培養(yǎng)至第7天時，貼壁細(xì)胞即為骨髓巨噬細(xì)胞。加入終濃度分別為50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml的MTB Hsp60刺激巨噬細(xì)胞。

1.2.2Real-time PCR法檢測相關(guān)分子的表達(dá)水平 取上述骨髓巨噬細(xì)胞，按照試劑盒說明書提取總RNA。采用紫外分光光度儀測定所提RNA濃度和純度。以總RNA為模板，Oligo(dt)為引物，mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行程序擴增，反應(yīng)體系:ddH2O 8.5 μl，SYBR 12.5 μl，cDNA 2 μl，上下游引物(表1) 各1 μl，總體積25 μl。反應(yīng)參數(shù)：5℃，10 min；95℃，15 s；60℃，30 s；39個循環(huán)。實驗數(shù)據(jù)用 2- ΔΔCt法(Ct為熒光達(dá)到閾值時所需 PCR的循環(huán)數(shù))分析各處理組細(xì)胞內(nèi)PⅠ、PⅣ、PⅢ、PⅣ、CⅡTA、IL-27的相對表達(dá)量。

表1 Real-time PCR的引物序列

1.2.3F4/80、MHCⅡ、CD86表達(dá)檢測 分別吸取100 μl細(xì)胞懸液,加入 10 μl FITC-F4/80、PE-MHCⅡ,然后再分別加入10 μl PECY5-CD86單克隆抗體,室溫下避光孵育 15～20 min,加入20 μl 0.5%甲醛固定,流式細(xì)胞儀檢測。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 所有資料采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析兩種濃度不同時間點的PCR數(shù)據(jù)差異，采用單因素方差分析3種濃度刺激后流式分析的數(shù)據(jù)差異，采用獨立樣本t檢驗分析同一時間不同濃度間PCR數(shù)據(jù)差異。指標(biāo)在3個時間點的總體比較以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，3個時間點兩兩比較以P<0.017表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義,兩種濃度同一時間比較以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩種濃度MTB Hsp60刺激小鼠骨髓巨噬細(xì)胞后相關(guān)分子mRNA表達(dá)情況 在體外培養(yǎng)條件下，50 ng/ml與100 ng/ml Hsp60分別刺激小鼠骨髓巨噬細(xì)胞后取貼壁細(xì)胞進(jìn)行Real-time PCR檢測不同濃度以及不同時間點細(xì)胞因子mRNA相對表達(dá)水平，測得RNA濃度為422.4 ng/μl，RNA純度為1.91，濃度和純度均適合做PCR。結(jié)果顯示，50 ng/ml MTB Hsp60刺激小鼠骨髓巨噬細(xì)胞后CⅡTA、PⅣ、IL-27、PⅠ在3個時間點的mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，3個時間點兩兩比較，CⅡTA在72 h的表達(dá)與24 h的表達(dá)相比明顯降低(P<0.017)，PⅣ在48 h的表達(dá)與24 h的表達(dá)相比明顯降低(P<0.017)，IL-27在48 h的表達(dá)與24 h的表達(dá)相比明顯降低(P<0.017)，72 h的表達(dá)與24 h的表達(dá)相比明顯升高(P<0.017)，PⅠ在48 h的表達(dá)與24 h的表達(dá)相比明顯降低(P<0.017)。見表2～4。100 ng/ml MTB Hsp60刺激后CⅡTA、IL-27、PⅠ在3個時間點的總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，3個時間點兩兩比較，IL-27在48 h、72 h的表達(dá)與24 h的表達(dá)相比明顯升高(P<0.017)，PⅠ在72 h、48 h的表達(dá)與24 h的表達(dá)相比明顯升高(P<0.017)。100 ng/ml MTB Hsp60刺激后的PⅢ、PⅠ、CⅡTA的mRNA表達(dá)水平與50 ng/ml刺激后相比明顯降低(P<0.05)，而PⅣ的mRNA表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)。結(jié)果見表2～4。

表2 兩種濃度Hsp60三個時間點刺激的基因表達(dá)結(jié)果(2-ΔΔCT)

表3 三個時間點兩種濃度Hsp60刺激的基因表達(dá)結(jié)果(2-ΔΔCT)

表4 兩種濃度Hsp60刺激的基因表達(dá)結(jié)果(2-ΔΔCT)

2.2比較不同濃度MTB Hsp60刺激后MHCⅡ/F4/80、CD86/F4/80的差異 200 ng/ml MTB Hsp60刺激后MHCⅡ/F4/80的表達(dá)百分比明顯低于50 ng/ml 刺激后的水平，而CD86/F4/80的表達(dá)百分比明顯增高(P<0.05)。在3組不同濃度指標(biāo)變化比較中，MHCⅡ/F4/80的表達(dá)百分比均明顯高于CD86/F4/80(P<0.05)，結(jié)果見表5、圖1。

表5 不同濃度Hsp60刺激后MHCⅡ/F4/80、CD86/F4/80的流式分析百分比(%)

圖1 不同濃度MTB Hsp60刺激小鼠骨髓巨噬細(xì)胞各指標(biāo)表達(dá)情況Fig.1 Indexs expression status of bone marrow of mice macrophages by different concentrations of MTB Hsp60 stimulatedNote:A.Expression of MHC Ⅱ/F4/80 and CD86/F4/80 after stimulation of bone marrow of mice macrophages with 50 ng/ml MTB Hsp60;B.MHCⅡ/F4/80,CD86/F4/80 isotype control after 50 ng/ml MTB Hsp60 stimulated bone marrow of mice macrophages;C.Negative control group of MHCⅡ/F4/80 and CD86/F4/80 after 50 ng/ml MTB Hsp60 stimulated bone marrow of mice macrophages;D.Expression of MHCⅡ/F4/80 and CD86/F4/80 after stimulation of bone marrow of mice macrophages with 100 ng/ml MTB Hsp60;E.Expression of MHCⅡ/F4/80 and CD86/F4/80 after stimulation of bone marrow of mice macrophages with 200 ng/ml MTB Hsp60.

3 討論

巨噬細(xì)胞是MTB的主要抗原提呈細(xì)胞[5]。MTB基因組攜帶2組Groel基因，分別編碼Groel1和Groel2蛋白，而Groel1是Hsp60蛋白的擬似物。結(jié)核桿菌與Groel1結(jié)合成的肽復(fù)合物被巨噬細(xì)胞識別吞噬后，降解加工成為具有免疫原性的小分子肽段，部分肽段與MHCⅡ類分子CD80、CD86結(jié)合后轉(zhuǎn)運至巨噬細(xì)胞表面表達(dá)，激活CD4 T細(xì)胞進(jìn)一步調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能。某些MTB與Groel1結(jié)合的肽復(fù)合物被巨噬細(xì)胞降解與MHCⅠ類分子結(jié)合，進(jìn)入高爾基體經(jīng)糖化修飾后轉(zhuǎn)運至巨噬細(xì)胞表面，被CD8 T細(xì)胞識別，通過裂解或誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡而發(fā)揮殺菌活性。

反式激活因子CⅡTA被認(rèn)為是MHCⅡ類分子表達(dá)最關(guān)鍵的調(diào)控分子，其表達(dá)水平與MHCⅡ類分子的轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)。PⅠ、PⅢ和PⅣ是CⅡTA的表達(dá)調(diào)控轉(zhuǎn)錄的啟動子，巨噬細(xì)胞需3個啟動子共同調(diào)控CⅡTA的轉(zhuǎn)錄。IL-27是IL-12家族細(xì)胞因子，廣泛作用于不同類型的細(xì)胞而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，能夠誘導(dǎo)單核細(xì)胞CⅡTA和MHCⅡ類分子的表達(dá)。F4/80即小鼠含生長因子樣模體黏液樣激素樣受體，是巨噬細(xì)胞表面的特異性抗原，參與巨噬細(xì)胞的成熟和活化過程。CD86分子是抗原提呈細(xì)胞 (antigen presenting cell,APC)重要的共刺激分子，以單體的形式表達(dá)于APC表面。

本研究顯示在兩種不同濃度MTB Hsp60刺激小鼠巨噬細(xì)胞后CⅡTA的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，且在24 h、48 h也有所降低(P<0.05)，50 ng/ml MTB Hsp60刺激后CⅡTA在72 h的表達(dá)與24 h的表達(dá)相比明顯降低(P<0.05)，提示MTB Hsp60作用于小鼠骨髓巨噬細(xì)胞的時間越長，濃度越高，CⅡTA降低越明顯。因此MTB Hsp60刺激后CⅡTA不能正常啟動MHCⅡ基因的轉(zhuǎn)錄，MHCⅡ基因不能正常向CD4+T細(xì)胞表達(dá)外來抗原，也就是適應(yīng)性免疫不能正常啟動。王翠妮等[6]報道MTB刺激鼠巨噬細(xì)胞后細(xì)胞懸液的CⅡTA及其啟動子PⅠ、PⅢ和PⅣmRNA相對表達(dá)水平降低。CⅡTA的變化通過降低原發(fā)性縱隔淋巴瘤中MHCⅡ類分子的表達(dá)實現(xiàn)免疫逃逸[7]，這與本研究中 Hsp60蛋白刺激后CⅡTA的變化相符，提示MTB Hsp60可能通過降低CⅡTA啟動子的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)巨噬細(xì)胞表面 MHCⅡ類分子的表達(dá)，從而實現(xiàn)免疫逃逸。

MTB Hsp60刺激小鼠骨髓巨噬細(xì)胞后，PⅠ在不同濃度刺激后3個時間點的總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，50 ng/ml MTB Hsp60刺激后PⅠ在48 h的表達(dá)與24 h的表達(dá)相比明顯降低(P<0.05)，100 ng/ml MTB Hsp60刺激后PⅠ在72 h、48 h 的表達(dá)與24 h的表達(dá)相比明顯增高(P<0.05)。結(jié)果提示在不同時間不同濃度MTB Hsp60刺激可上調(diào)或下調(diào)PⅠ在小鼠巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平。Pacis等[8]報道PⅠ控制樹突細(xì)胞的MHCⅡ的構(gòu)成性表達(dá),Hsp60的刺激影響了樹突細(xì)胞的甲基化導(dǎo)致PⅠ表達(dá)上調(diào)。PⅠ是CⅡTA的表達(dá)調(diào)控轉(zhuǎn)錄的啟動子，本研究中PⅠ與CⅡTA的下降反應(yīng)一致，但是在不同濃度和時間表現(xiàn)出不同轉(zhuǎn)錄變化，是否有甲基化或者其他影響還需進(jìn)一步的研究。MTB Hsp60刺激小鼠骨髓巨噬細(xì)胞，PⅢ在100 ng/ml MTB Hsp60刺激后與50 ng/ml刺激后相比其mRNA表達(dá)水平有所降低(P<0.05)，而PⅣ的mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)。50 ng/ml MTB Hsp60刺激后PⅣ在3個時間點的總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，3個時間點兩兩比較，結(jié)果顯示PⅣ在48 h的表達(dá)與24 h 的表達(dá)相比明顯降低(P<0.05)，提示高濃度MTB Hsp60可下調(diào)PⅢ在巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平，表明PⅢ與CⅡTA的下降反應(yīng)一致；高濃度MTB Hsp60上調(diào)PⅣ在巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平，且PⅣ在低濃度刺激的時間越長，降低越明顯，提示PⅣ對MTB Hsp60的刺激在巨噬細(xì)胞中表現(xiàn)出不同的的轉(zhuǎn)錄水平，PⅣ的表達(dá)隨時間延長而下調(diào)，其對不同濃度刺激表現(xiàn)出不同表達(dá)水平的原因有待進(jìn)一步研究。Chang等[9]認(rèn)為MTB干擾 MHCⅡ類分子的表達(dá)合成，能持續(xù)抑制抗原的提呈，以逃避免疫監(jiān)視而建立潛伏感染。這與本研究結(jié)果大致相符。其可能的原因是巨噬細(xì)胞內(nèi)MTB不能被完全清除而產(chǎn)生免疫逃逸，MTB Hsp60抑制小鼠巨噬細(xì)胞的抗原提呈功能。

IL-27上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中MHCⅡ類和MHCⅠ類分子的表達(dá),可增強THP-1細(xì)胞表面共刺激分子CD80和CD86及黏附分子CD54的表達(dá),表明IL-27可促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞的抗原提呈功能[10]。本研究中MTB Hsp60刺激小鼠骨髓巨噬細(xì)胞，50 ng/ml MTB Hsp60刺激后IL-27 mRNA表達(dá)水平在3個時間點的總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，IL-27的mRNA表達(dá)水平在48 h刺激后與24 h刺激后相比明顯降低(P<0.017)，而72 h刺激后與24 h刺激后的表達(dá)相比有明顯升高(P<0.017)；100 ng/ml MTB Hsp60刺激后IL-27 mRNA在3個時間點的總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，3個時間點兩兩比較，結(jié)果顯示IL-27 mRNA在48 h、72 h比24 h的表達(dá)有明顯升高(P<0.05)。提示MTB Hsp60可以刺激小鼠骨髓巨噬細(xì)胞分泌IL-27且隨著刺激濃度增加和時間延長而增高，表明MTB Hsp60能促進(jìn)巨噬細(xì)胞中IL-27轉(zhuǎn)錄，從而正向調(diào)控IL-27的產(chǎn)生。巨噬細(xì)胞受 MTB 刺激后可分泌 IL-27，在MTB感染中主要表現(xiàn)出抑制巨噬細(xì)胞固有免疫應(yīng)答[11]，抑制細(xì)胞自噬作用，進(jìn)而導(dǎo)致 MTB 在胞內(nèi)長期存在。IL-27在結(jié)核菌感染過程中發(fā)揮雙重作用，雖然阻止了抗結(jié)核菌的保護(hù)性免疫反應(yīng)，但可以限制慢性炎癥造成的最終病理損害[12]。這些結(jié)果將有助于進(jìn)一步了解Hsp60和IL-27在固有免疫中抗原提呈反應(yīng)中的調(diào)控機理,并為疫苗研制提供潛在的靶點。

本研究中，MHCⅡ/F4/80百分比在3個濃度的比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，MHCⅡ/F4/80在200 ng/ml處理組的表達(dá)水平明顯低于50 ng/ml處理組，而CD86/F4/80在200 ng/ml處理組的表達(dá)水平明顯高于50 ng/ml處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示MTB Hsp60刺激濃度越高，小鼠骨髓巨噬細(xì)胞MHCⅡ的表達(dá)降低越明顯，CⅡTA是調(diào)控MHCⅡ類分子轉(zhuǎn)錄表達(dá)的最重要因子，決定 MHCⅡ類分子的表達(dá)水平。在本研究中CⅡTA啟動子受MTB Hsp60刺激后其轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，因而巨噬細(xì)胞表面 MHCⅡ類分子的表達(dá)降低。Aravindhan等[13]發(fā)現(xiàn)Groel1操縱子控制了分枝桿菌中Groel1的表達(dá)，在巨噬細(xì)胞感染時可迅速上調(diào)。Groel1可能誘導(dǎo)激活巨噬細(xì)胞且通過TLR-4介導(dǎo)的信號途徑調(diào)控巨噬細(xì)胞抗原提呈功能，參與MTB的慢性感染過程[14]。本研究中MTB Hsp60刺激小鼠骨髓巨噬細(xì)胞后共刺激分子CD86明顯升高，這與Riffo等[15]報道Hsp60作為抗感染因素明顯影響?zhàn)じ椒肿拥谋磉_(dá)相符。有研究報道TLR7和 TLR9影響小鼠骨髓巨噬細(xì)胞抗原提呈功能從而影響 MHCⅡ和CD86表達(dá)[16]。也就是說MTB Hsp60刺激后會抑制小鼠骨髓巨噬細(xì)胞MHC類抗原MHCⅡ表達(dá)，從而影響抗原提呈功能，這可能是MTB逃避宿主保護(hù)性免疫反應(yīng)的主要機制之一。

本課題組前期研究顯示結(jié)核病潛伏感染患者與肺結(jié)核患者外周血Groel1蛋白與一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的濃度呈正相關(guān)[17]。免疫活化的巨噬細(xì)胞在氧化酶(NOX2/gp91phox)和誘導(dǎo)型的iNOS 催化下產(chǎn)生的抗菌活性物ROS和RNS也能有效抵抗MTB感染[18]。MTB可以通過干擾巨噬細(xì)胞抗原提呈和避免反應(yīng)氧和反應(yīng)氮產(chǎn)物的毒性效應(yīng)等多種途徑逃逸巨噬細(xì)胞的免疫殺傷。Sharma等[19]報道Groel1可通過影響低氧組織的基因表達(dá)從而保證結(jié)核桿菌在低氧下存活。同時有研究報道感染的鼠模型缺乏Groel1后不能產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[20]。

綜上所述，MTB Hsp60刺激小鼠骨髓巨噬細(xì)胞后CⅡTA、PⅣ、IL-27、PⅠ、PⅢ的 mRNA水平有不同變化，且受到MTB Hsp60濃度和時間的影響，提示MTB Hsp60可以影響小鼠骨髓巨噬細(xì)胞MHCⅡ類分子的表達(dá)。MHCⅡ類分子隨MTB Hsp60刺激濃度的增加而減少，而CD86升高，提示MTB Hsp60抑制小鼠骨髓巨噬細(xì)胞MHCⅡ類分子的表達(dá)。Hsp60蛋白可以抑制巨噬細(xì)胞抗原提呈功能從而逃避巨噬細(xì)胞的免疫殺傷，導(dǎo)致MTB感染，進(jìn)而增加MTB在細(xì)胞內(nèi)存活、增殖，進(jìn)一步導(dǎo)致MTB慢性感染和潛伏感染。本研究結(jié)果可為后續(xù)深入探討Hsp60蛋白對MTB 感染巨噬細(xì)胞的影響及結(jié)核潛伏感染機制提供重要的實驗和理論依據(jù)。在進(jìn)一步實驗中，本課題組將繼續(xù)對結(jié)核感染和潛伏感染患者外周血的巨噬細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)研究。