超聲波輔助萃取波羅蜜種子多酚工藝研究

周昂摺，周巧婷，周恩牧，金建忠

（浙江樹人大學 生物與環(huán)境工程學院，浙江 杭州 310015）

波羅蜜Artocarpus heterophyllus為桑科Moraceae 波羅蜜屬Artocarpus植物，是典型的熱帶果樹，原產(chǎn)于印度，現(xiàn)在我國廣東、廣西、海南、云南、福建和四川南部的熱帶、南亞熱帶地區(qū)均有栽培[1]。波羅蜜果肉爽脆、蜜甜、芳香味濃，肉色橙黃鮮艷，富含糖、蛋白質、維生素A、維生素C 以及人體所必須的鉀、鈣、鋅等元素[2]。目前，對波羅蜜加工利用的部分主要是其果肉，而其果皮和種子通常被當作廢棄物丟棄，這不但浪費資源，而且對環(huán)境造成污染[3]。波羅蜜種子呈橢圓形，不僅富含淀粉，還含有脂肪、揮發(fā)油、多酚、蛋白質和纖維素等，是有待開發(fā)加工利用的新資源[4]。目前，對波羅蜜種子的研究主要集中在其淀粉特性及提取制備上[4]，對其多酚的研究較少[5]。植物多酚亦稱植物單寧，其在抗氧化、抗突變、抗腫瘤等很多方面具有突出作用和廣泛的保健功能，其中，最重要的是抗氧化功能[6]。現(xiàn)有對植物多酚的提取方法主要有溶劑提取法[7-9]、離子沉淀法[10-12]、超聲波輔助提取法[13-14]、微波輔助提取法[15-16]、生物酶提取法[17-19]、超臨界CO2提取法[21-22]等。本文以波羅蜜種子為研究對象，采用超聲波輔助萃取技術提取多酚，通過單因素和正交試驗進行提取工藝的優(yōu)化實驗，以期為波羅蜜種子開發(fā)新的利用方向，減少環(huán)境污染。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

沒食子酸，福林酚試劑，無水Na2CO3，95%乙醇（分析純）；波羅蜜種子（購自廣東湛江，為當年生種子）。

1.2 儀器與設備

LSA-E24/1200 超聲波清洗器（杭州法蘭特超聲波科技有限公司），Evolution 201 紫外可見分光光度計(中國Thermo)，AB204-N 電子天平（美國奧豪斯）。

1.3 實驗方法

1.3.1 超聲波輔助萃取方法 將在100℃干燥至恒質量的波羅蜜種子直接粉碎并過30 目篩，獲得波羅蜜種子粉末。精確稱取0.400 0 g 波羅蜜種子粉末于25 mL 比色管中，首先固定超聲時間為40 min，料液比為1∶50（g·mL-1），超聲功率為85 W，超聲溫度為50℃，改變乙醇濃度進行乙醇濃度單因素試驗，當溫度達到設定值時將比色管放入儀器中超聲萃取，超聲結束后過濾得提取液。確定最佳乙醇濃度后再依次進行其他因素的試驗。

為了全面考察超聲波輔助萃取波羅蜜種子多酚時各因素對其的影響，在單因素實驗的基礎上設計正交試驗?？疾斐暅囟龋ˋ）、超聲時間（B）、超聲功率（C）、料液比（D）和乙醇濃度（E）五個因素對波羅蜜種子多酚產(chǎn)量的影響，選用L16(45)正交表，考察因素、水平及正交試驗結果見表1。

表1 正交試驗結果及分析Table 1 Result of orthogonal test and analysis

1.3.2 多酚的測定

1.3.2.1 標準曲線繪制 準確吸取40 μg·mL-1沒食子酸標準溶液0，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL 分別置于6 支25 mL 具塞比色管中，依次加入8.75 mL 的20%福林酚試劑、5.00 mL7.5%的Na2CO3溶液，加水定容，放置40 min 后以空白樣品為參比溶液，在760 nm 波長處測其吸光度。以濃度（C）為橫坐標，以吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線，其回歸方程為：

1.3.2.2 最佳波長的選擇 按1.3.2.1 的測定方法分別測定沒食子酸和波羅蜜種子多酚提取液的吸收曲線，見圖1。由圖1 可知，沒食子酸和波羅蜜種子多酚提取液經(jīng)顯色反應后的光譜曲線形狀相似，均在760 nm 處有最大吸收。所以，測定波羅蜜種子多酚含量可以用沒食子酸作為標準物質，同時，以760 nm 為最佳波長。

1.3.2.3 波羅蜜種子多酚的測定 將超聲波輔助萃取所得的多酚提取液置于25 mL 容量瓶，用水定容，移取上述樣品溶液1.25 mL 于25 mL 具塞比色管，按標準曲線測定方法測定其吸光度，由沒食子酸標準溶液的線性回歸方程計算出比色管中波羅蜜種子多酚提取液的濃度C，并計算波羅蜜種子中多酚的產(chǎn)量，其方程如下：

圖1 沒食子酸和波羅蜜種子多酚吸收曲線Figure 1 Absorption curves of gallic acid and polyphenols

1.4 數(shù)據(jù)分析

圖表數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析用Graphpad Prism 軟件，正交設計及分析采用正交設計助手軟件。

2 結果與分析

2.1 波羅蜜種子多酚的超聲波輔助萃取單因素實驗

2.1.1 乙醇濃度對波羅蜜種子多酚提取量的影響 固定超聲時間40 min，料液比1∶50，超聲功率85 W，超聲溫度50℃，控制乙醇濃度分別為60%，65%，70%，75%，80%時進行萃取，結果見圖2。由圖2 可知，波羅蜜種子多酚提取量隨著乙醇濃度的升高呈先增加后降低的趨勢，在乙醇濃度為60%～ 70%時，提取效果呈現(xiàn)上升趨勢，到70%時提取效果為最佳，多酚提取產(chǎn)量達3.688 mg·g-1；當乙醇濃度高于70%時，提取效果逐漸下降。

2.1.2 超聲溫度對波羅蜜種子多酚提取的影響 固定乙醇濃度為70%，料液比為1∶50，超聲時間為40 min，超聲功率為85 W，控制超聲溫度分別為35℃，40℃，45℃，50℃，55℃時進行波羅蜜種子多酚提取，結果見圖3。由圖3 可知，隨著處理溫度的逐漸上升，提取效果呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在超聲溫度在35～ 45℃時，提取效果呈現(xiàn)上升趨勢，當溫度達到45℃時提取效果最佳，多酚提取產(chǎn)量達3.938 mg·g-1。當溫度高于45℃時，提取效果呈下降趨勢。這是因為溫度過低，乙醇提取波羅蜜種子多酚不完全，但溫度過高酒精揮發(fā)量增多，使提取效果降低。

圖2 乙醇濃度對波羅蜜種子多酚提取量的影響Figure 2 Effect of ethanol concentration on yield of polyphenols from A.heterophyllus seeds

圖3 超聲溫度對波羅蜜種子多酚提取量的影響Figure 3 Effect of ultrasonic temperature on yield of polyphenols from A.heterophyllus seeds

2.1.3 料液比對波羅蜜種子多酚提取量的影響 固定超聲溫度為45℃，乙醇濃度為70%，超聲時間為40 min，超聲功率為85 W，控制波羅蜜種子粉末和乙醇的料液比分別為1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60 時進行提取，結果見圖4。由圖4 可知，隨著乙醇用量的增多，提取效果呈現(xiàn)上升趨勢，當料液比達到1:40 時提取效果達到最佳，為3.952 mg·g-1。當料液比低于1∶40 時，提取效果基本保持不變。這是因為在乙醇用量達到一定量時，加入的乙醇所能提取出多酚的量已經(jīng)達到飽和，當乙醇用量繼續(xù)增加，料液比達到1∶40 時，其樣品中的多酚最大限度的被提取出來，所以料液比低于1∶40 后提取效果基本不變。

2.1.4 超聲時間對波羅蜜種子多酚提取量的影響 在超聲溫度為45℃，料液比為1∶40，乙醇濃度為70%，超聲功率為85 W，超聲時間分別為10 min，20 min，30 min，40 min，50 min 時進行波羅蜜種子多酚提取，結果見圖5。由圖5 可知，隨著超聲時間的增加，提取效果呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當超聲時間在10～ 30 min 時，提取效果呈現(xiàn)上升趨勢，當超聲時間達到30 min 時，提取效果達到最佳，為4.275 mg·g-1；當超聲時間超過30 min時提取效果有所降低，這是因為前30 min 是隨著提取時間的延長，其提取越完全，但超過30 min 后隨著超聲時間的增加，其提取液中的乙醇揮發(fā)量增大，使其提取液中的有效乙醇濃度降低，從而使多酚提取量減少。

圖4 料液比對波羅蜜種子多酚提取量的影響Figure 4 Effect of solid-liquid ratio on yield of polyphenols from A.heterophyllus seeds

圖5 超聲時間對波羅蜜種子多酚提取量的影響Figure 5 Effect of ultrasonic time on yield of polyphenols from A.heterophyllus seeds

2.1.5 超聲功率對波羅蜜種子多酚提取量的影響 固定超聲時間為30 min，料液比為1∶40，超聲溫度為45℃，乙醇濃度為70%，改變超聲功率分別為55 W，65 W，75 W，85 W，95 W 時進行提取，結果見圖6。由圖6 可知，隨著超聲功率的增大，空化強度增大，多酚提取量呈現(xiàn)上升趨勢，當超聲功率達到65 W 時，提取效果達到最佳，為5.030 mg·g-1。但超聲功率過高會產(chǎn)生大量的無用氣泡，增加散射衰減，形成聲屏障，同時也會增加非線性衰減，故當超聲功率高于65 W 時多酚提取量呈現(xiàn)下降趨勢。

2.2 超聲波輔助萃取波羅蜜種子多酚的正交試驗

由正交試驗結果（見表1）表明，波羅蜜種子多酚的超聲波輔助萃取各因素對多酚產(chǎn)量影響程度的大小順序為：E＞A＞D＞C＞B。最佳提取條件為A3B1C1D4E1，即超聲溫度為45℃、超聲時間為10 min、超聲功率為55 W、料液比為1∶50、乙醇濃度為60%。

由表2 的方差分析結果表明，超聲波輔助萃取各因素對多酚產(chǎn)量影響程度的大小順序為：E＞A＞D＞C＞B，與表1 的直觀分析結果一致，且各因素的F值＜F0.05（3，3），表明各萃取條件對多酚產(chǎn)量的影響都不顯著。

圖6 超聲功率對波羅蜜種子多酚提取量的影響Figure 6 Effect of ultrasonic power on yield of polyphenols from A.heterophyllus seeds

表2 方差分析Table 2 Analysis of variance

2.3 驗證試驗

在正交實驗所得的最佳萃取條件下重復萃取波羅蜜種子3 次，所得多酚的產(chǎn)量分別為5.261 mg·g-1，5.395 mg·g-1，5.451 mg·g-1，平均產(chǎn)量為5.368 mg·g-1。此提取條件與正交試驗任意組對比，均大于各組萃取量，驗證了所確定條件為最佳工藝條件。

3 結論

本文采用超聲波輔助萃取了波羅蜜種子中的多酚，通過單因素試驗和正交試驗考察了超聲時間、超聲溫度、乙醇濃度、料液比、超聲功率5 種因素對波羅蜜種子多酚產(chǎn)量的影響。實驗結果表明，各因素對波羅蜜種子多酚產(chǎn)量影響的大小順序為：乙醇濃度＞超聲溫度＞超聲功率＞料液比＞超聲時間；其最佳萃取工藝條件為：超聲溫度45℃、超聲時間10 min、超聲功率55 W、料液比1∶50、乙醇濃度60%，在此條件下波羅蜜種子多酚產(chǎn)量達5.368 mg·g-1。但該工藝的料液比過低，在工業(yè)化生產(chǎn)時會造成濃縮能耗過大的問題，有待進一步研究解決。