ADRB1/2、NEDD4L基因多態(tài)性與急性失血人群自主神經(jīng)調(diào)節(jié)功能的相關(guān)性

王 利 劉生敏 莊勤武 崔曉純 劉 衛(wèi)，

1.山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，山東 泰安 271016； 2.濟寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濟寧 272000；3.聯(lián)勤保障部隊第九六〇醫(yī)院(泰安院區(qū))，山東 泰安 271000； 4.濱州醫(yī)學(xué)院煙臺附屬醫(yī)院，山東 煙臺 264000

自主神經(jīng)系統(tǒng)(autonomic nervous system，ANS)包括交感和副交感神經(jīng)系統(tǒng)，血壓穩(wěn)定受交感和副交感神經(jīng)雙重調(diào)節(jié)，動脈壓力感受器感受血壓的變化，血壓降低動脈壓力感受器刺激性減弱，引起交感神經(jīng)興奮使血壓升高。心率變異性(heart rate variability，HRV)指心臟連續(xù)搏動(R-R間期)之間的微小差異[1]，常用來定量描述自主神經(jīng)功能，據(jù)報道HRV的改變與心血管功能調(diào)節(jié)蛋白的基因多態(tài)性相關(guān)[2-3]。腎上腺受體β1-AR和β2-AR是自主神經(jīng)主要受體，β1-AR主要作用于心臟，通過心臟交感神經(jīng)-腎上腺系統(tǒng)調(diào)節(jié)血壓，冠脈、骨骼肌血管和平滑肌以β2-AR占優(yōu)勢，激動β2-AR可激活腺苷酸環(huán)化酶(AC)，使ATP轉(zhuǎn)化為cAMP，引起血管平滑肌舒張，血壓下降，代表交感神經(jīng)的ADRB1(rs1801253)的G/C多態(tài)性和ADRB2(rs1042713)的G/A多態(tài)性是β1-AR和β2-AR常見的單核苷酸多態(tài)性，目前已有大量研究表明ADRB1(rs1801253)、ADRB2( rs1042713)位點基因多態(tài)性與高血壓密切相關(guān)[4-6]，上皮鈉通道通路(ENaC-NEDD4L-SGK1)是血壓調(diào)節(jié)的關(guān)鍵通道[7]，受神經(jīng)前體細(xì)胞表達發(fā)育調(diào)控蛋白NEDD4L的調(diào)控,通過ENac泛素化影響鈉離子重吸收，NEDD4L(rs4149601)的 G/A基因多態(tài)性與高血壓、體位性低血壓顯著相關(guān)[8-9]，據(jù)此推斷ADRB1(rs1801253)、ADRB2(rs1042713)、NEDD4L(rs4149601)位點基因多態(tài)性都可能影響自主神經(jīng)的調(diào)節(jié)功能。

以往研究表明獻血350～400 mL以上會引起自主神經(jīng)的顯著變化，代表交感神經(jīng)活性的LF增加，代表迷走神經(jīng)活性的HF降低，這種自主神經(jīng)主動的調(diào)節(jié)可維持進行性低血容量失血情況下的血壓穩(wěn)定[10-11]，但約1.6%的人由于迷走神經(jīng)活性增強，易發(fā)生血管迷走神經(jīng)反應(yīng)[12-13]，與休克早期的表現(xiàn)相似。由此，本次實驗以一次獻血400 mL模擬急性失血，將進行性低血容量失血后反應(yīng)與HRV分析結(jié)合起來，探討在獻血狀態(tài)下，ADRB1(rs1801253)、ADRB2(rs1042713)和NEDD4L(rs414601)基因多態(tài)性與自主神經(jīng)調(diào)節(jié)功能的相關(guān)性，也為急性失血時易發(fā)生休克人群的早期防治提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

以39名無償獻血400 mL青年志愿者為實驗對象，年齡18～25(22±3.1)歲，體檢無器質(zhì)性病變者，排除引起自主神經(jīng)功能紊亂的因素，無情緒障礙，未使用藥物。實驗對象一般資料見表1，除ADRB2攜帶突變等位基因人群與野生型心血管病家族史差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其它差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本實驗及實施已通過倫理委員會批準(zhǔn)，且均在觀察對象簽署知情同意基礎(chǔ)上完成。

表1 實驗對象基線情況比較

1.2 方法

1.2.1DNA提取與擴增 收集實驗對象2 mL靜脈血，HiPure Blood DNA Mini Kit提取DNA，參照各基因全序列用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，見表2。MJ PTC-100 PCR擴增ADRB1，ADRB2和NEDD4L基因相應(yīng)片段。PCR反應(yīng)總體積60 μL，2×Bench TopTM Tap Master Mix 30 μL，上游引物和下游引物各2.4 μL(10 u)，模板DNA 3 μL，加滅菌蒸餾水22.2～60 μL；反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物送北京華大基因采用Sanger測序法進行測序，測序結(jié)果用Chromas軟件進行判讀分析。

表2 各基因PCR引物序列

1.2.25 min心電信號采集 采用CB-1304-C動態(tài)心電記錄儀(無錫中鍵科儀有限公司)，采集研究對象獻血前后坐式體位、安靜狀態(tài)下5 min的心電信號，由CB系列心電血壓回顧分析系統(tǒng)獲取HRV時域和頻域指標(biāo)數(shù)值，采用的HRV指標(biāo)見表3。

表3 HRV分析常用指標(biāo)

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 基因型判定

經(jīng)北京華大基因測序分析，研究人群中ADRB1( rs1801253)攜帶C等位基因者21例，其中突變型(C/C)6例，雜合型(G/C)15例，野生型(G/G)18例；ADRB2(rs1042713)攜帶A等位基因者30例，突變型(A/A)21例，雜合型(G/A)9例，野生型(G/G)9例；NEDD4L(rs4149601)攜帶A等位基因15例，突變型(A/A)3例，雜合型(G/A)12例，野生型(G/G)24例。ADRB1基因測序圖譜見圖1～3。

圖1 ADRB1基因測序圖譜

圖2 ADRB2基因測序圖譜

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗

對本次研究群體進行遺傳平衡吻合度檢驗，結(jié)果表明ADRB1、ADRB2和NEDD4L基因基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡，表明具有群體代表性。

2.3 基因多態(tài)性與獻血前后HRV指標(biāo)分析

ADRB1(rs1801253)、ADRB2(rs1042713)、NEDD4L(rs4149601)基因各位點野生型和突變基因攜帶者失血前后HRV指標(biāo)見表4～7。獻血前基礎(chǔ)狀態(tài)下，ADRB1(rs1801253)位點C等位基因攜帶者PNN50高于G/G型人群(P<0.05)，ADRB2(rs1042713)位點A等位基因攜帶者HF高于野生型，LF/HF低于G/G型人群(P<0.05)，NEDD4L(rs4149601)位點A等位基因攜帶者SDNN、PNN50、HF高于G/G型人群(P<0.05)；獻血后A等位基因攜帶者不僅SDNN和HF，LF指標(biāo)也高于G/G型人群(P<0.05)。獻血前后，ADRB1(rs1801253)位點C等位基因攜帶者PNN50的增高幅度高于G/G型人群(P<0.05)，ADRB2(rs1042713)位點A等位基因攜帶者LF增高幅度大于G/G型人群(P<0.05)，NEDD4L(rs4149601)位點A等位基因攜帶者PNN50增高幅度顯著低于G/G型人群(P<0.05)。

表4 ADRB1、ADRB2、NEDD4L基因多態(tài)性獻血前HRV比較

表5 ADRB1、ADRB2、NEDD4L基因多態(tài)性獻血后HRV比較

表6 ADRB1、ADRB2、NEDD4L基因多態(tài)性獻血前后HRV改變幅度比較

3 討 論

自主神經(jīng)系統(tǒng)受到交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)的雙重調(diào)節(jié)，HRV反應(yīng)了交感和迷走神經(jīng)的活動及平衡關(guān)系，是目前評價自主神經(jīng)功能最敏感的指標(biāo)[14-16]，它包括時域(SDNN、PNN50)和頻域(LF、HF、LF/HF)指標(biāo)，能夠反應(yīng)交感和副交感神經(jīng)張力的變化，PNN50及HF主要反應(yīng)迷走神經(jīng)活動，SDNN反應(yīng)總的自主神經(jīng)活動，LF反應(yīng)交感神經(jīng)活動，LF/HF反應(yīng)交感/迷走神經(jīng)平衡[17]。腎上腺受體是自主神經(jīng)的主要受體，在調(diào)節(jié)交感神經(jīng)活性上發(fā)揮重要作用。β-腎上腺受體(β-AR)基因多態(tài)性與血壓的關(guān)系是近年來的研究熱點，ADRB1(rs1801253)的G/C多態(tài)性和ADRB2(rs1042713)的G/A多態(tài)性是β1-AR和β2-AR常見的單核苷酸多態(tài)性，已有大量研究發(fā)現(xiàn)它們的多態(tài)性與血壓相關(guān)。有研究表明NEDD4L(rs4149601)與體位性低血壓相關(guān)，體位性低血壓受自主神經(jīng)的調(diào)節(jié)，因此，推測NEDD4L(rs4149601)是自主神經(jīng)的相關(guān)基因。目前國內(nèi)外尚未見有報道上述所有位點基因多態(tài)性與自主神經(jīng)相關(guān)性的研究報道，本研究以一次獻血400 mL刺激激活交感神經(jīng)活性下，探究ADRB1(rs1801253)、ADRB2(rs1042713)、NEDD4L(rs4149601)位點基因多態(tài)性與自主神經(jīng)調(diào)節(jié)功能的相關(guān)性。

本研究結(jié)果表明，ADRB1(rs1801253)位點C等位基因攜帶者HRV指標(biāo)中PNN50高于(G/G)基因型人群，且獻血前后PNN50的增高幅度也顯著高于G/G基因型人群，這說明ADRB1(rs1801253)位點C等位基因攜帶者，獻血后交感神經(jīng)活動性減弱，迷走神經(jīng)活性相對占優(yōu)勢，可能更易發(fā)生血管迷走神經(jīng)反應(yīng)。既往在一項針對亞洲人群的研究中也顯示，ADRB1(rs1801253)攜帶C突變基因的人群更容易發(fā)生低血壓[18]。獻血前ADRB2(rs1042713)攜帶A突變基因人群HF高于(G/G)野生型人群，LF/HF則低于G/G基因型人群，獻血后攜帶A突變基因人群LF雖高于G/G基因型人群，但LF/HF仍較低，雖然獻血前后A突變基因攜帶者人群LF的增高幅度比較大，但總體上依然是A突變基因攜帶者迷走神經(jīng)較G/G型人群占優(yōu)勢，以往也有研究發(fā)現(xiàn)ADRB2(rs1042713)攜帶A等位基因者LF顯著降低[19-20]。獻血前NEDD4L(rs4149601)A突變基因攜帶者SDNN、PNN50、HF顯著高于G/G基因型人群，說明此時A突變基因攜帶者迷走神經(jīng)活性較高，獻血后A突變基因攜帶者不僅SDNN和HF，LF指標(biāo)也顯著高于G/G基因型人群，且獻血前后A突變基因攜帶者PNN50的增高幅度顯著低于G/G型人群，提示NEDD4L(rs4149601)A突變基因攜帶者對獻血后反射性激活交感神經(jīng)活性的反應(yīng)性高。

本相關(guān)性研究結(jié)果顯示，在一次獻血400 mL狀態(tài)下，上述研究的3個基因中ADRB1(rs1801253)位點C等位基因攜帶者與ADRB2(rs1042713)位點A等位基因攜帶者代表迷走神經(jīng)活性的HRV指標(biāo)顯著增加，推測這些人群獻血時更易發(fā)生血管迷走神經(jīng)反應(yīng)，而在失血性休克早期更易出現(xiàn)休克癥狀。而NEDD4L(rs4149601)位點A等位基因攜帶者NEDD4L(rs4149601)A突變基因攜帶者對獻血后反射性激活交感神經(jīng)活性的反應(yīng)性高，推測A突變基因攜帶是失血性休克早期的保護因素。