國內(nèi)新發(fā)危險(xiǎn)性橡膠樹擬盤多毛孢葉斑病鑒定及其病原學(xué)研究

李博勛 劉先寶 時(shí)濤 蔡吉苗 鄭肖蘭 馮艷麗 徐春華 黃貴修

摘? 要：基于目前橡膠樹擬盤多毛孢葉斑病在境外主要植膠國爆發(fā)流行的態(tài)勢，以及對天然橡膠產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)帶來的巨大影響。筆者前期對我國海南、云南、廣東等省橡膠主產(chǎn)區(qū)的13個(gè)農(nóng)場和膠園進(jìn)行了病害踏查，在我國海南省樂東縣志仲鎮(zhèn)樂東保顯農(nóng)場發(fā)現(xiàn)了疑似橡膠樹擬盤多毛孢葉斑病病樣。本研究將該疑似病樣病原菌進(jìn)行分離、純化和致病力測定，并通過形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)分析，確定該病原菌為新擬盤多毛孢屬（Neopestalotiopsis）的Neopestalotiopsis aotearoa Maharachch.， K.D. Hyde & Crous;基礎(chǔ)生物學(xué)特性分析表明，該病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的適宜溫度為28 ℃，孢子致死溫度為50 ℃;適宜pH為6.5，最適碳源為蔗糖和D-葡萄糖，最適氮源為硝酸鉀和大豆蛋白胨;最適培養(yǎng)基為PDA，培養(yǎng)8 d后產(chǎn)孢。初步明確了該病的病原及其基礎(chǔ)生物學(xué)特性，為提前儲(chǔ)備防治該病的相關(guān)技術(shù)措施提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：橡膠樹;擬盤多毛孢葉斑病;病原鑒定;生物學(xué)特性

中圖分類號：S794.1;S763.7? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Abstract： Based on the current outbreak and epidemic situation of a novel Neopestalotiopsis leaf fall disease of rubber trees （Hevea brasiliensis） in major rubber planting countries abroad and its great impact on natural rubber industry economy， the authors conducted a preliminary inspection on 13 farms and rubber plantations in main rubber producing areas in Hainan， Yunnan and Guangdong provinces， and found suspected disease samples in Baoxian Farm， Zhizhong Town， Ledong County， Hainan. In this study， the pathogens of the suspected disease samples were isolated， purified and the pathogenicity was determined. Through morphological and molecular phylogenetic analysis， the pathogen was identified as Neopestalotiopsis aotearoa Maharachch.， K.D. Hyde & Crous. The basic biological characteristics showed that the suitable temperature for the mycelial growth and spore germination was 28 ℃， the lethal temperature of spores was 50 ℃. The optimum pH value was 6.5， the optimum carbon sources were sucrose and D-glucose， the optimum nitrogen sources were potassium nitrate and soybean peptone， and the optimum medium was PDA， which could produce spores after eight days. The pathogen and its basic biological characteristics were preliminarily identified， which would provide theoretical basis for the reserve of related technical measures for the prevention and control of the disease in advance.

Keywords： Hevea brasiliensis; Neopestalotiopsis leaf fall disease; pathogen identification; biological characteristics

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.08.016

橡膠樹（Hevea brasiliensis）原產(chǎn)于南美洲的亞馬遜河流域，主要分布在巴西、秘魯和哥倫比亞，其中，巴西是南美洲最主要的產(chǎn)膠國。由于受到橡膠樹南美葉疫病（South American Leaf Blight，SALB）的嚴(yán)重影響，導(dǎo)致全球天然橡膠產(chǎn)業(yè)格局發(fā)生了重大的、歷史性的轉(zhuǎn)變，由原產(chǎn)地南美洲向亞洲、非洲等地遷移。目前，全球的天然橡膠主要分布在東南亞、南亞和非洲地區(qū)，其中亞洲的產(chǎn)膠量占全球的90.8%。天然橡膠是我國重要的戰(zhàn)略性物質(zhì)資源，也是關(guān)系到國計(jì)民生和國家安全建設(shè)的可再生綠色資源。自2011年后，隨著全球天然橡膠貿(mào)易價(jià)格的不斷下滑，引發(fā)了橡膠產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)下滑、膠林減毀、膠農(nóng)貧困等一系列問題[1]。膠園的長期失管，使得許多新病害在一些植膠國頻繁爆發(fā)流行。2014年在我國海南主要農(nóng)場的中小齡膠樹和開割樹上普遍爆發(fā)流行的由Fusarium solani引起的莖桿潰瘍病，引起膠樹爆皮流膠，中小齡苗枝條回枯[2];同年在云南西雙版納發(fā)現(xiàn)的由F. oxysporum引起的莖基腐病，導(dǎo)致膠樹莖桿基部腐爛流膠[3];2015年在云南西雙版納發(fā)現(xiàn)了由Alternaria alternata引起的黑斑病[4];2016年在馬來西亞、印度尼西亞、越南爆發(fā)流行的由Neofusicoccum ribis引起的橡膠樹殼梭孢葉斑病，也引起很大的關(guān)注[5]。2019年9月，國際橡膠研究與發(fā)展委員會(huì)（IRRDB）年會(huì)的橡膠生產(chǎn)國聯(lián)合發(fā)布，由擬盤多毛孢屬（Neopestalotiopsis sp.）真菌引起的橡膠樹擬盤多毛孢葉斑病已在馬來西亞、印度尼西亞、斯里蘭卡等多個(gè)植膠國家爆發(fā)流行，導(dǎo)致橡膠樹大量落葉，疫情擴(kuò)散蔓延迅速，短時(shí)間內(nèi)難以得到有效防控，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，引起各植膠國的高度重視[6]。2019年，該病已在印度尼西亞的北蘇門答臘（North Sumatra）、南蘇門答臘（South Sumatra）、邦加（Bangka）等8個(gè)省、17個(gè)橡膠農(nóng)場爆發(fā)流行，發(fā)病面積達(dá)103 254 hm2，落葉率達(dá)75%～90%，且田間無抗性品種[7]。2019年1月，在泰國南部的那拉提瓦?。∟arathiwas）首次發(fā)現(xiàn)該病，之后迅速蔓延至邦納（Pangna）、蘇拉塔尼（SuratThani）、宋克拉（Songkhla）等8個(gè)省，截止2020年1月泰國累計(jì)發(fā)病面積達(dá)112 530 hm2，并且受西南季風(fēng)影響，該病害可能會(huì)進(jìn)一步蔓延至泰國東部地區(qū)以及柬埔寨[8]。短短幾年時(shí)間該病在亞洲的主要植膠國爆發(fā)流行，潛在威脅巨大。

基于目前該病害在主要植膠國爆發(fā)流行的態(tài)勢，以及對天然橡膠產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)帶來的嚴(yán)重影響。2020年5—7月，筆者先后對海南樂東保顯農(nóng)場、白沙大嶺農(nóng)場、瓊中陽江農(nóng)場、儋州西聯(lián)農(nóng)場、國家橡膠樹種質(zhì)資源圃;廣東農(nóng)墾總局下設(shè)的五一農(nóng)場、南華農(nóng)場、建設(shè)農(nóng)場、紅峰農(nóng)場、廣東農(nóng)墾熱帶作物研究所、中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所;云南省熱帶作物科學(xué)研究所、河口螞蝗堡農(nóng)場等13個(gè)農(nóng)場和橡膠園進(jìn)行橡膠樹擬盤多毛孢葉斑病的踏查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在海南省樂東縣志仲鎮(zhèn)樂東保顯農(nóng)場（18°37′30.27″N，109°19′58.47″E）2年生的橡膠實(shí)生苗上發(fā)現(xiàn)了疑似橡膠樹擬盤多毛孢葉斑病病樣。此外，筆者在白沙大嶺農(nóng)場的老膠園里也發(fā)現(xiàn)了疑似病樣，其他農(nóng)場以及中小齡和成齡膠樹上尚未發(fā)現(xiàn)該病的疑似病樣。鑒于該病在全球?qū)儆谛掳l(fā)病害，在我國也是首次發(fā)現(xiàn)，目前也只是在橡膠實(shí)生苗上零星發(fā)生，尚未造成大面積危害。為此，為了更好地應(yīng)對、預(yù)防和監(jiān)測該病在國內(nèi)的發(fā)生和危害，本研究將前期發(fā)現(xiàn)的疑似病樣進(jìn)行分離、純化、鑒定、病原學(xué)以及多基因序列分析，對病原菌進(jìn)行鑒定，并研究其基礎(chǔ)生物學(xué)特性，更好地了解病害的基本情況，為提前儲(chǔ)備防治該病的相關(guān)技術(shù)措施提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 病樣? 病樣于2020年5月采自我國海南省樂東縣志仲鎮(zhèn)樂東保顯農(nóng)場（18°37′30.27″N，109°19′58.47″E）。

1.1.2? 供試菌株和材料? 2株擬盤多毛孢菌株（表1）均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所分離、鑒定與保存;從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載了19個(gè)擬盤多毛孢模式種的基因信息（表1）與國內(nèi)的菌株共建系統(tǒng)發(fā)育樹;致病力測定選用的橡膠樹品種為PR107，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所演豐基地保存。

1.1.3? 培養(yǎng)基和試劑? 用于分析病原菌生長特性所用的PDA培養(yǎng)基、Richards培養(yǎng)基、玉米培養(yǎng)基、胡蘿卜培養(yǎng)基、V8培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基等均參照《植病研究方法》配制[9]。引物（表2）均由深圳華大基因科技有限公司合成;PCR擴(kuò)增反應(yīng)所需的Buffer、Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker等購自天根生化科技（北京）有限公司。DH5α大腸桿菌Escherichia coli感受態(tài)細(xì)胞購自寶生物工程（大連）有限公司。其他化學(xué)試劑、藥品等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4? 儀器與設(shè)備? Bio-Rad T100型梯度PCR儀，美國伯樂公司;UVI FireReader凝膠成像系統(tǒng)，英國UVItec公司;Nikon NI/E型生物智能熒光顯微鏡，日本Nikon公司。

1.2? 方法

1.2.1? 病菌分離、純化及其致病性測定? 采用常規(guī)病原菌分離方法[9]對橡膠樹擬盤多毛孢疑似病樣葉片進(jìn)行病原菌的分離及純化。依照柯赫氏法則[11]，選取田間健康橡膠樹葉片（品種為PR107）置于帶有吸水紙的托盤內(nèi)，采用菌餅穿刺接種法[12]將分離物接種到淡綠色期的橡膠葉片上，以不含病原菌的PDA培養(yǎng)基作為空白對照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，然后將接種后的樣品置于28 ℃培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，每天觀察葉片的發(fā)病情況，5 d后從病、健交界處重新分離、純化病原菌，從菌落形態(tài)、培養(yǎng)性狀以及孢子形態(tài)特征上與最初分離得到的菌株進(jìn)行對比，確認(rèn)病原菌的致病性。

1.2.2? 病原鑒定? 形態(tài)學(xué)鑒定：觀察并記錄病原菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、菌絲顏色、產(chǎn)孢情況等特征。用顯微鏡觀察分生孢子的形態(tài)特征、顏色、大小、附屬絲長度等。

分子生物學(xué)鑒定：采用CTAB方法[10]提取病原菌基因組DNA，用ITS、TEF、TUB等多基因的引物序列（表2）對病原菌目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序和條件參照Pornsuriya等[10]的方法，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并對目的條帶切膠回收，然后將目的基因連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑選陽性克隆轉(zhuǎn)化子，其中的3個(gè)克隆送至深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行序列測定。

1.2.3? 多基因序列分析、遺傳距離計(jì)算和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建? 將ITS、TEF、TUB等基因序列在NCBI中進(jìn)行單基因序列的BLAST比對，利用CodonCode Aligner V7.0.1去除測序峰圖的低質(zhì)量區(qū)域，完成峰圖校對拼接和引物序列切除，然后將ITS、TEF、TUB的部分序列進(jìn)行拼接，應(yīng)用PAUP 4.0軟件計(jì)算種內(nèi)遺傳距離;利用MEGA 10軟件最大似然法中的Tamura-Nei model構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4? 病原菌基礎(chǔ)生物學(xué)特性測定? 在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)8 d的菌落中，加入5 mL滅菌水洗下孢子，制成濃度為1.0106個(gè)/mL的孢子懸浮液，再滴到干凈的載玻片上，同時(shí)用無菌打孔器在菌落邊緣打取直徑為4.5 mm菌齡相同的菌餅接種到PDA培養(yǎng)基平板上，然后分別將載玻片和接菌的PDA平板置于10、15、20、25、28、30、35、40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，8 h后統(tǒng)計(jì)孢子的萌發(fā)率，7 d后觀察不同溫度下菌絲的生長情況。用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，高溫高壓滅菌后制成平板備用，每個(gè)pH 3個(gè)重復(fù);用等當(dāng)量的C源：蔗糖、葡萄糖、D-木糖、D-山梨醇、D-乳糖、D-果糖、D-麥芽糖，氮源：KNO3、NH4NO3、（NH4）2SO4、NH4Cl、（NH4）2C2O4、牛肉浸膏、大豆蛋白胨依次替換Richards培養(yǎng)基中的蔗糖和KNO3，以不加任何C源（蔗糖）和N源（NaNO3）的Richards培養(yǎng)基作為對照，高溫高壓滅菌滅菌后，制成平板備用，每個(gè)碳、氮源3個(gè)重復(fù);分別配制燕麥、玉米、胡蘿卜、麥芽、PDA、PSA、LB、V8、Richards培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基重復(fù)3次。然后將病原菌依次接種到不同pH，不同碳、氮源的培養(yǎng)基平板中央并置于28 ℃恒溫箱培養(yǎng)。7 d后觀察不同條件下病原菌的生長情況。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用十字交叉法測量病原菌的菌落直徑，計(jì)算菌絲的生長速率，采用SAS 9.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 田間癥狀及病原菌的分離

2020年5月，筆者在海南省樂東縣保顯農(nóng)場的2年生橡膠實(shí)生苗的老葉上發(fā)現(xiàn)了疑似橡膠樹擬盤多毛孢葉斑病的癥狀，葉片受害部位最初褪綠呈黃色水漬狀，隨后形成黑褐色、近圓形的病斑（圖1A），病斑進(jìn)一步擴(kuò)大形成中央灰白色，外圍有黑褐色壞死線和黃色暈圈的病斑，受害葉片從葉柄處脫落，僅剩下葉柄掛在樹上（圖1B、圖1C）;濕度大時(shí)，在病斑中央散生許多小黑點(diǎn)。另外，時(shí)濤等[13]在泰國甲米府調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn)，該病除葉片外還能為害嫩梢、嫩枝、綠色膠果、種子等。但在國內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)該病為害嫩枝和膠果。將病樣采回實(shí)驗(yàn)室，從病健交界處分離病原菌，將病原菌進(jìn)行單孢純化后保存，菌株編號為HNPeHNLD2001和HNPeHNLD2002。

按照柯赫氏法則[11]將分離獲得的HNPeHNLD2001和HNPeHNLD2002菌株進(jìn)行致病性測定，結(jié)果表明：分離得到的2株病原菌，經(jīng)致病力測定后的發(fā)病癥狀與田間自然發(fā)病的癥狀相同，然后在發(fā)病部位將病原菌進(jìn)行分離，所得病原菌從菌落形態(tài)、培養(yǎng)性狀以及孢子的形態(tài)特征都與在田間自然發(fā)病分離得到的病原菌的形態(tài)特征相同，說明分離得到的2株病原菌為疑似病樣的致病菌（圖2）。

2.2? 病原鑒定

2.2.1? 形態(tài)學(xué)鑒定? HNPeHNLD2001和HNPeHNLD2002菌株在培養(yǎng)性狀上略有差異，但孢子形態(tài)特征相同。HNPeHNLD2001菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落邊緣成波浪狀，一層一層向外生長;菌絲白色濃密，菌落背面略微黃色（圖3）。HNPeHNLD2002菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落圓形、邊緣整齊無波浪狀;菌絲白色濃密，菌落背面略微黃色（圖4）。2個(gè)菌株在PDA上培養(yǎng)8 d后開始產(chǎn)孢，15～20 d后在菌絲上散生著許多黑色的分生孢子群落（圖5）。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：病原菌的分生孢子長梭形，有的稍微彎曲，每個(gè)分生孢子是4隔5細(xì)胞;分生孢子大小為18.35～ 27.12 ?m×（4.11～7.03）?m（隨機(jī)測量100個(gè)以上的分生孢子），中間3個(gè)細(xì)胞均為褐色，成熟的有色胞第三色胞顏色略淺，淺褐色，第二色胞顏色最深，深褐色，第三色胞次之;有色胞長12.53～18.97（15.26）?m。頂胞和尾胞均為三角形，無色透明;頂胞上著生無色附屬絲，2～3根，長14.7～25.3（19.94）?m;尾胞上著生一根基部附屬絲，中生，長3.13～7.13（5.48）?m（圖6）;芽管是從第三個(gè)有色胞側(cè)面萌發(fā)。參照Maharach-chikumbura等[14]的研究結(jié)果，從培養(yǎng)性狀和孢子形態(tài)特征上與Neopestalotiopsis aotearoa的描述最為接近（表3）。

2.2.2? 多基因序列分析及病原菌種群鑒定? 用ITS1/ITS4、EF1-728F/EF1-986R和T1/Bt2b 3種引物對HNPeHNLD2001和HNPeHNLD2002菌株進(jìn)行ITS區(qū)、EF-1α和TUB序列擴(kuò)增，分別得到大小約為513、264、808 bp的條帶。菌株序列在NCBI經(jīng)BLAST比對分析，均為新擬盤多毛孢屬真菌（Neopestalotiopsis sp.），并將各單基因的序列提交至GeneBank（表1）。通過序列間的比對發(fā)現(xiàn)，在ITS1區(qū)的第35位點(diǎn)存在單核苷酸多態(tài)性（A/G），在466位點(diǎn)處有一個(gè)T的缺失;在TUB序列的第137位點(diǎn)存在單核苷酸多態(tài)性（T/C），其他序列完全一致。

采用3種多基因的部分序列進(jìn)行拼接，將HNPeHNLD2001和HNPeHNLD2002菌株與NCBI下載的擬盤多毛孢模式種共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖7），發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因的加和序列能較好地反映新擬盤多毛孢（Neopestalotiopsis sp.）種間和種內(nèi)的遺傳關(guān)系，有較高的種間、種內(nèi)的區(qū)分度和分辨率，多數(shù)的進(jìn)化分枝都有較高自舉支持率，不同模式種的菌株間也存在豐富的遺傳多樣性。根據(jù)多基因序列聚類分析，利用最大似然法，在相似系數(shù)為0.97時(shí)可將國內(nèi)的HNPeHNLD2001和HNPeHNLD2002兩個(gè)菌株與N. aotearoa（CBS 367.54）劃分在同一分支上，遺傳距離最近，支持率為70%。這與泰國Pornsuriya等[10]報(bào)道的2種橡膠樹擬盤多毛孢葉斑病菌N. formicarum和N. cubana存在一定差異，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。為此，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定和多基因序列分析結(jié)果，將國內(nèi)為害橡膠樹的擬盤多毛孢葉斑病病原鑒定為半知菌類、腔孢綱、黑盤孢目、新擬盤多毛孢屬（Neope-stalotiopsis）的N. aotearoa Maharachch.， K.D. Hyde & Crous。

2.3? 病原菌生物學(xué)特性分析

生物學(xué)特性測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HNPeHNLD2001和HNPeHNLD2002菌株菌絲生長的最適溫度為28 ℃，低于15 ℃和高于35 ℃將會(huì)抑制病原菌的生長（圖8A）;分生孢子適宜溫度范圍在28～30 ℃之間，最適溫度是28 ℃，低于10 ℃或高于40 ℃都會(huì)影響孢子的萌發(fā)（圖8B）;50 ℃為孢子的致死溫度。菌絲生長適宜的pH為6.5（圖8C）。2個(gè)菌株在含D-乳糖培養(yǎng)基中的菌絲生長最快，但菌絲十分稀薄，長勢不好;在含有蔗糖和D-葡萄糖的培養(yǎng)基中菌絲濃密、生長旺盛，說明蔗糖和D-葡萄糖是該菌生長的最適C源（圖8D）。另外，2個(gè)菌株以硝酸鹽為N源的利用率明顯優(yōu)于銨鹽，在含KNO3和大豆蛋白胨的培養(yǎng)基上生長速度最快，菌絲最濃密，是該菌生長的最適N源（圖8E）。在供試的9種培養(yǎng)基中，2個(gè)菌株在PDA和PSA上的生長最好，在PSA上的產(chǎn)孢量最多（表4）。

3? 討論

2017年11月在馬來西亞和印度尼西亞首次發(fā)現(xiàn)橡膠樹擬盤多毛孢葉斑病，之后迅速蔓延。該病導(dǎo)致成熟葉片大量脫落，嚴(yán)重影響橡膠樹的光合作用，中小齡膠樹葉片脫落，枝條回枯，成齡膠樹減產(chǎn)50%以上[7]。據(jù)報(bào)道，在馬來西亞很多無性系種質(zhì)如：RRIM2001、RRIM2025、RRIM2023、PB260和PB350均受害，且目前尚無田間抗性種質(zhì)，截止2019年12月，該病已在馬來西亞的9個(gè)州發(fā)生為害[15]，并且在印度尼西亞、泰國、斯里蘭卡等主要植膠國爆發(fā)流行，潛在巨大威脅。2020年5—7月，筆者通過調(diào)查，在海南省樂東縣保顯農(nóng)場發(fā)現(xiàn)了疑似橡膠樹擬盤多毛孢葉斑病的癥狀，通過形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)的鑒定最終確定采集的疑似病樣為Neopestalotiopsis aotearoa引起的橡膠樹擬盤多毛孢葉斑病。該病目前在我國膠園尚未造成大面積為害，但也不能忽視其潛在的危害性。

新擬盤多毛孢屬（Neopestalotiopsis）真菌是熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛存在的一類真菌。這類真菌的植物來源廣泛，寄主專一性不高，屬兼性寄生菌，以多種營養(yǎng)方式生存，且各種營養(yǎng)方式之間可以相互轉(zhuǎn)變，適應(yīng)能力強(qiáng)，能夠引起多種植物的病害，是一種重要的植物病原菌[16]。據(jù)國內(nèi)報(bào)道，該菌能侵染為害50多科植物，特別是茶等經(jīng)濟(jì)作物和園林觀賞植物受害嚴(yán)重，能形成葉斑、葉枯、枝枯、根腐及果實(shí)潰瘍等癥狀，嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量、品質(zhì)和觀賞性[17]。擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）是Steyeaer于1949年建立命名的，從盤多毛孢屬（Pestalotia）分離出來的分生孢子具5細(xì)胞的一個(gè)屬，按照新的分類系統(tǒng)，Pestalotiopsis屬于無性態(tài)真菌（Anamophic fungi），其有性態(tài)（Pestalosphaeria Margret﹠Barr）很難發(fā)現(xiàn)[18]。長期以來，擬盤多毛孢屬的分類及種的鑒定主要依據(jù)分生孢子形態(tài)特征來區(qū)分，但是培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件會(huì)對分生孢子的形態(tài)特征產(chǎn)生一定影響，使得每個(gè)菌株的培養(yǎng)性狀存在一定的變化，主要表現(xiàn)在分生孢子的顏色、形態(tài)和附屬絲的長度等。僅僅依據(jù)形態(tài)學(xué)特征來鑒定擬盤多毛孢屬及其近緣屬，會(huì)導(dǎo)致種間界限嚴(yán)重重疊，不能準(zhǔn)確反映系統(tǒng)關(guān)系，因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子系統(tǒng)學(xué)的手段，從遺傳進(jìn)化上來分析擬盤多毛孢屬的多樣性，對其種和近緣種的鑒定更為準(zhǔn)確[19]。

本研究基于國內(nèi)新發(fā)擬盤多毛孢葉斑病菌的形態(tài)學(xué)，利用ITS、EF-1α和TUB 3個(gè)基因序列共同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，將其病原鑒定為新擬盤多毛孢屬（Neopestalotiopsis）的N. aotearoa。該菌最早于1954年在新西蘭Canvas發(fā)現(xiàn)的一種致病菌，它主要營兼性寄生生活，目前在其他作物上鮮有報(bào)道。從系統(tǒng)進(jìn)化樹來看N. aotearoa分屬于N. piceana的一個(gè)分枝（圖7），遺傳距離較近，但在分生孢子的形態(tài)特征上存在明顯差異[14]。Febbiyanti等[20]報(bào)道的馬來西亞橡膠樹擬盤多毛孢病原為Pestalotiopsis sp.，暫未鑒定到種;Pornsuriya等[10]研究發(fā)現(xiàn)引起泰國橡膠樹擬盤多毛孢葉斑病的病原有N. cubana和N. formicarum。泰國和馬來西亞報(bào)道的橡膠樹擬盤多毛孢葉斑病病原與我國的不是同一個(gè)種，推測是國內(nèi)本地種侵染上來的，極可能適應(yīng)國內(nèi)的氣候環(huán)境，從病害的發(fā)病條件、爆發(fā)流行的環(huán)境因素、病原菌的適生性等方面都可能不同于泰國和馬來西亞病原，為此，研究國內(nèi)菌株病原學(xué)就尤為重要。從基礎(chǔ)生物學(xué)特性分析結(jié)果來看，該菌喜酸性的環(huán)境條件，溫度高于35 ℃，低于10 ℃均不利于該菌生長，且高溫高濕有利于孢子的萌發(fā)。該病在田間的典型癥狀為病斑中央灰白色，邊緣黑褐色壞死線，周圍有明顯的黃色暈圈，這與Pornsuriya等[10]報(bào)道的泰國的基本一致。人工接種的葉片至第5天后能出現(xiàn)與田間自然發(fā)病相同的癥狀，但形成的壞死線和黃暈沒有田間自然發(fā)病條件下的明顯，保濕培養(yǎng)下能在病斑中央看到黑色的分生孢子群落。

橡膠樹擬盤多毛孢葉斑病在我國屬于新發(fā)危險(xiǎn)性病害，在亞洲主要植膠國已經(jīng)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，在國際上也備受關(guān)注。由于該病在各國的為害程度不一樣，管控措施也不相同，對該病的了解程度也不一樣，目前尚未形成防治該病的完整的技術(shù)體系。近年來，由于受國際天然橡膠市場價(jià)格的影響，橡膠產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)嚴(yán)重下滑，很多膠園都處于棄管狀態(tài)，新病害頻頻發(fā)生，次要病害也上升為主要病害，長此以往，病害的防治難度也將越來越大。因此，為了更好地應(yīng)對、預(yù)防和控制該病在國內(nèi)進(jìn)一步的發(fā)生和為害，應(yīng)積極探索病害的發(fā)生規(guī)律及流行條件，為提前儲(chǔ)備防治該病的相關(guān)技術(shù)措施提供理論依據(jù)。同時(shí)也呼吁廣大的橡膠生產(chǎn)單位、農(nóng)場及相關(guān)科研人員，密切關(guān)注該病的發(fā)生、發(fā)展動(dòng)態(tài)，及時(shí)掌握病害疫情，儲(chǔ)備相關(guān)防治技術(shù)措施，嚴(yán)防該病的進(jìn)一步傳播與蔓延。

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