文心蘭響應(yīng)軟腐病菌脅迫的生理生化分析

吳秋楨 林爭春 倪珊珊 賴鐘雄

摘? 要：通過細(xì)菌性軟腐病菌液針刺接種文心蘭‘小櫻桃假鱗莖，分別在0、8、16、24、32 h時取假鱗莖上第一片葉，測定其葉綠素?zé)晒馓匦訹最大光合效率Fv/Fm、實際光合效率Y（Ⅱ）、調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)額Y（NPQ）、非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)額Y（NO）]，超氧化物歧化酶（SOD），過氧化物酶（POD），過氧化氫酶（CAT），多酚氧化酶（PPO）的酶活性，丙二醛（MDA），木質(zhì)素及可溶性糖含量的變化。結(jié)果表明，隨著侵染時間的延長，F(xiàn)v/Fm、Y（Ⅱ）、Y（NPQ）逐漸下降，Y（NO）逐漸升高，光合系統(tǒng)受損;PPO活性及木質(zhì)素含量逐漸下降;SOD、POD活性逐漸升高;CAT活性與可溶性糖含量先上升后下降;MDA含量在0～24 h逐漸下降，24 h后趨于平緩。探明文心蘭感染軟腐病后其抗性機制，建立抗性鑒定的生理方法。

關(guān)鍵詞：文心蘭;軟腐病;生理生化指標(biāo);葉綠素?zé)晒馓匦?木質(zhì)素

中圖分類號：S682.31? ? ? 文獻標(biāo)識碼：A

Abstract： The pseudobulb of Sherry Baby， Oncidium was infected by bacterial soft rot bacteria infection. The first leaf on the pseudobulb was sampled 0， 8， 16， 24， 32 h， after infection to determine the chlorophyll fluorescence properties [Fv/Fm， Y（Ⅱ）， Y（NPQ）， Y（NO）]， superoxide dismutase（SOD）， peroxidase（POD）， catalase（CAT）， polyphenol oxidase（PPO） activity， malondialdehyde （MDA）， lignin， and the change of soluble sugar content. The results showed that with the extension of infection time， Fv/Fm， Y（Ⅱ）， Y（NPQ） gradually decline， Y（NO） increased， and the photosynthetic system was damaged. PPO activity and lignin content decreased gradually; SOD and POD activity increased gradually; CAT activity and soluble sugar content first increased and then decreased; MDA content decreased gradually from 0 to 24 h and then leveled off after 24 h. The study would heip to explore the resistance mechanism and establish the physiological method of resistance identification.

Keywords： Oncidium spp.; soft rot; physiological and biochemical indexes; chlorophyll fluorescence properties; lignin

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.08.015

文心蘭（Oncidium spp.）又名舞女蘭。其花枝長，花小而繁多，花姿優(yōu)美，花色艷麗，是一種觀賞價值較高的洋蘭，被廣泛用作切花材料和盆栽觀賞。我國主要在臺灣、福建、廣東、云南、海南等地種植，研究表明其在15～25 ℃環(huán)境生長最適宜[1]，而福建夏季高溫多雨，正值文心蘭切花產(chǎn)期，易受病原菌浸染，由歐文氏菌（Erwinia spp.）侵染而引起的軟腐?。╯oft rot）是文心蘭栽培生產(chǎn)最致命的病害之一，感病后植株迅速水漬化，后期常引起整株植株腐爛致死[2]，危害嚴(yán)重且暫無有效的防治措施，越來越引起人們的關(guān)注。

植物感染軟腐病后，會產(chǎn)生系列生理生化變化。白菜[3]、梨[4]等植物在感病后均呈現(xiàn)不同的生理狀態(tài)，目前，學(xué)者對大花惠蘭[5]、蝴蝶蘭[6]等蘭科植物響應(yīng)軟腐病脅迫進行相關(guān)研究，但未見有關(guān)文心蘭感染軟腐病生理變化的報道，因此，本實驗以‘小櫻桃文心蘭（Oncidium cv. Sherry Baby）接種軟腐病菌液，檢測其葉綠素?zé)晒馓匦缘淖兓?，SOD、POD、CAT、PPO活性，MDA、木質(zhì)素和可溶性糖含量等，探明文心蘭感染軟腐病后其生理生化指標(biāo)的變化規(guī)律，揭示侵染機制，為篩選文心蘭抗軟腐病植株及防治軟腐病提供參考依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

材料由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供。選擇1年生生長良好，且長勢一致的‘小櫻桃文心蘭組培移栽苗。注射10 L的軟腐病菌液（OD值為0.4）于文心蘭假鱗莖，將植株套袋并放置在氣候箱中，設(shè)置溫度為36 ℃，濕度80%，光照強度為2000 lx和16 h光照、8 h黑暗循環(huán)處理。每組設(shè)3個對照，依次在0、8、16、24、32 h取樣。處理結(jié)果如圖1，取樣后用液氮預(yù)冷處理并保存于80 ℃冰箱備用。

1.2? 方法

1.2.1? 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定? 采用葉綠素?zé)晒獬上駜xIMAGING-PAM（Germany， Walz），測定感染軟腐病后最上部第一片葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，包括PSII最大光合效率（Fv/Fm）、實際光合效率[Y（Ⅱ）]、PSII調(diào)節(jié)性和非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)額[Y（NPQ）與Y（NO）]等指標(biāo)。測定前對各處理的葉片暗適應(yīng)遮光30 min，以確保PSII反應(yīng)中心完全開放，各組處理設(shè)置2次重復(fù)，每樣品測定5個區(qū)域。根據(jù)儀器說明書設(shè)定工作參數(shù)進行操作，系統(tǒng)運行結(jié)束后自動給出參數(shù)值，PSII最大光合效率通過公式Fv/Fm=（FmFo）/Fm計算獲得。

1.2.2? 相關(guān)生理指標(biāo)測定? 取文心蘭葉片測定SOD、CAT、POD、PPO、MDA、木質(zhì)素和可溶性糖等相關(guān)生理生化指標(biāo)，3次重復(fù)。測定均采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司的試劑盒，使用紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）測定相關(guān)波長下的吸光值，按照相關(guān)說明書進行操作和計算。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)分別采用Microsoft Excel、SPSS 17.0和GraphPad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計與分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 軟腐病對文心蘭葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.1.1? 文心蘭感染軟腐病前后Fv/Fm和Y（Ⅱ）的變化? 從圖2可知，侵染軟腐病后，隨處理時間的增加，文心蘭葉片PSII的Fv/Fm和Y（Ⅱ）變化趨勢基本一致，均呈下降趨勢，0～8 h和16～24 h時下降幅度較小，分別比對照下降1.93%和12.75%，8～16 h時下降幅度最大，為對照的11.40%，24～32 h時Fv/Fm和Y（Ⅱ）下降幅度差別較大，F(xiàn)v/Fm比對照下降17.79%，Y（Ⅱ）比對照降低21.91%。

2.1.2? 文心蘭感染軟腐病前后Y（NPQ）與Y（NO）的變化? 從圖3可知，侵染軟腐病后，隨處理時間的增加，Y（NPQ）與Y（NO）的變化呈相反趨勢。0～8 h時Y（NPQ）與Y（NO）變化緩慢，分別比對照降低和提高1.85%和7.40%;8～24 h時變化較大，Y（NPQ）降低11.55%，Y（NO）提高47.10%;24～36 h時Y（NPQ）與Y（NO）急劇下降和上升，Y（NPQ）下降至對照的22.78%，Y（NO）比對照提高了91.10%。

2.2? 文心蘭感染軟腐病前后植物防御酶活性的變化

2.2.1? 軟腐病侵染對文心蘭SOD活性的影響? 從圖4可知，侵染軟腐病后，隨處理時間的增加，文心蘭葉片中SOD活性呈不斷上升趨勢，但在不同時期活性增幅有顯著差異，處理0～8 h時SOD活性上升較緩，16～24 h時SOD活性上升同樣較緩，但比0～8 h上升快，8～16 h和24～32 h時SOD活性顯著提高。32 h后SOD活性為143.0783 U/g，比對照組20.1424 U/g提高7.1倍。

2.2.2? 軟腐病侵染對文心蘭CAT活性的影響? 從圖5可知，侵染軟腐病后，文心蘭葉片0～8 h時CAT活性與對照組沒有明顯變化，8～16 h時CAT活性持續(xù)上升，且在16 h達到最大值，為481.380 nmol/（min·g），比對照提高26.58%，16～24 h時CAT活性顯著下降，在24 h時活性與對照組相近，24～32 h時緩慢下降，此時CAT活性比對照組低10.92%。

2.2.3? 軟腐病侵染對文心蘭POD活性的影響? 從圖6可知，侵染軟腐病后，隨著處理時間的增加，文心蘭葉片POD活性呈不斷顯著上升的變化趨勢，且增幅較穩(wěn)定，8、16、24、32 h時POD活性分別比對照組增長21.43%、50.71%、85.71、114.29%。

2.2.4? 軟腐病侵染對文心蘭PPO活性的影響? 從圖7可知，侵染軟腐病后文心蘭葉片中PPO活性隨著處理時間的延長，總體呈下降趨勢。在不同時期，下降幅度有所差異，0～8 h下降明顯，比對照組降低18.25%，8～16 h呈平緩降低趨勢，降幅為22.50%，16～24 h和24～32 h下降幅度相同，至32 h時比對照組降低53.33%。

2.3? 軟腐病侵染對文心蘭MDA含量的影響

從圖8可知，侵染軟腐病后，0～16 h時文心蘭葉片MDA含量緩慢下降，但MDA含量0～8 h時比8～16 h降幅略大，16～24 h時繼續(xù)下降，且下降幅度顯著，至24 h時MDA含量降至最低，24～32 h時無明顯變化。

2.4? 軟腐病侵染對文心蘭木質(zhì)素含量的影響

從圖9可知，侵染軟腐病后，隨著處理時間的延長，文心蘭葉片木質(zhì)素含量呈先增加后降低的趨勢。0～8 h木質(zhì)素含量上升，比對照組高18.73%，8 h后開始下降，至16 h時與對照含量相近，16～ 24 h下降顯著，相比對照組低30.06%，24 h后變化不明顯。

2.5? 軟腐病侵染對文心蘭可溶性糖含量的影響

從圖10可知，侵染軟腐病后，文心蘭葉片中可溶性糖含量呈先增加后下降的趨勢，且上升與下降幅度明顯。0～16 h顯著增加，在16 h時達到最高水平，其含量為7.22 mg/g，16 h后開始下降，至32 h時比對照組低4.18%。

3? 討論

3.1? 軟腐病侵染后Fv/Fm和Y（Ⅱ）下降，葉綠體結(jié)構(gòu)可能受到破壞

葉綠素對光能的吸收、傳遞以及耗散等過程都可以通過葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化反映，其是描述植物光合作用機理和光合生理狀況的重要指標(biāo)[7]，在文心蘭淺綠條紋突變體中最大光合效率（Fv/Fm）和實際光合效率[Y（Ⅱ）]均比正常植株下降，是由于葉綠體結(jié)構(gòu)受到破壞[8]。而本研究中，文心蘭葉片的最大光合效率（Fv/Fm）、實際光合效率[Y（Ⅱ）]和調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)額[Y（NPQ）]在感染軟腐病后均不斷下降，而非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)額[Y（NO）]呈上升趨勢，這與任少華等[9]、李丹等[10]的研究結(jié)果一致，這表明文心蘭在感染軟腐病后，PSII反應(yīng)中心可能受到破壞，光合鏈上的電子傳遞軌道受阻，受光抑制作用。

3.2? 軟腐病侵染后期過氧化氫代謝失衡，自由基減少，防御酶系統(tǒng)受損

SOD、POD、CAT和PPO等作為防御酶系統(tǒng)，具有保護細(xì)胞免受損傷，對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用[7， 11]。SOD通過歧化反應(yīng)清除自由基，生成過氧化氫，POD和CAT使其含量上升[12]。本研究中， SOD與POD隨著感病時間的延長，活性不斷提高，這與病毒感染百合[12]、枯萎病脅迫西瓜[13-14]、病菌脅迫香蕉[15]結(jié)果一致。CAT活性呈先上升，隨后不斷降低趨勢，至低于對照組，表明感病后最初文心蘭體內(nèi)CAT活性增強，但這種變化可能無法滿足清除持續(xù)產(chǎn)生的過氧化氫，導(dǎo)致過氧化氫累積，引起植株體內(nèi)的過氧化氫代謝失衡，CAT活性不斷下降[16]。文心蘭感染軟腐病后，自由基含量達到相對穩(wěn)定，SOD清除自由基，生成過量的過氧化氫，POD與CAT又不斷地清除過量的過氧化氫，以減輕對植物體的傷害[17]。PPO與植物的抗病性有關(guān)，通過與底物結(jié)合，合成醌類物質(zhì)，構(gòu)建防御系統(tǒng)[18]。本研究中，隨著處理的延長，PPO活性不斷下降，這與張曉南等[19]的研究結(jié)果不同，可能是由于病原菌浸染，文心蘭腐爛，使其生理功能喪失所致。

3.3? 軟腐病侵染后期木質(zhì)素合成受阻，細(xì)胞壁強度下降，導(dǎo)致軟腐

MDA是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，其含量可作為逆境脅迫的重要指標(biāo)[20-21]。本研究中，文心蘭感染軟腐病后，隨著時間的延長，MDA含量不斷降低，這可能是軟腐病菌浸染細(xì)胞后，細(xì)胞膜體系遭到破壞，膜脂發(fā)生降解紊亂了植物細(xì)胞的生化平衡[22-23]，這在真菌對百合耐熱性[22]、木霉菌對黃瓜幼苗生長[24]的研究中有類似情況。木質(zhì)素的合成與POD、PPO、PAL等多種酶有關(guān)，植物通過改變木質(zhì)素的含量來調(diào)節(jié)細(xì)胞壁的強度，從而抵制病原菌入侵[20]，本實驗文心蘭葉片中木質(zhì)素在8 h時達到最大，隨后開始下降，這與遲建國[25]和王乾等[26]的研究結(jié)果一致，病原菌浸染初期，木質(zhì)素含量增加，從而提高細(xì)胞壁強度，抑制病原菌入侵。而一段處理時間后，相關(guān)合成酶降低，木質(zhì)素合成受損，組織軟腐?？扇苄蕴鞘菨B透調(diào)節(jié)物質(zhì)，幫助植物抵抗逆境，在浸染病原菌后，可溶性糖先增加后降低，表明在前期文心蘭通過提高可溶性糖含量來抵御病原菌的入侵，隨著處理時間延長，后期細(xì)胞被破壞，調(diào)節(jié)系統(tǒng)紊亂，可溶性糖顯著下降。這與富貴竹感染莖腐病、大豆感染根腐病[27-28]等有類似情況。

綜上所述，文心蘭‘小櫻桃品種在感染軟腐病后，葉綠體結(jié)構(gòu)受到破壞，光合作用受阻，防御酶系統(tǒng)遭到破壞，積累過量過氧化氫，自由基代謝失衡。同時，在感病后期，木質(zhì)素合成受阻，細(xì)胞壁強度下降，進一步導(dǎo)致軟腐。通過對葉綠素?zé)晒鈪?shù)及SOD、POD、CAT、PPO活性、丙二醛、木質(zhì)素、可溶性糖含量的規(guī)律性變化，可作為文心蘭抗病鑒定的關(guān)鍵指標(biāo)，為培育抗病品種提供參考。

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