Lys-GO 對PLCL 形狀記憶纖維的力學增強和成骨誘導作用

劉 暢， 易兵成， 王先流， 沈炎冰， 秦春萍， 張彥中

（東華大學化學化工與生物工程學院，上海 201620）

在全球范圍內(nèi)，每年有成千上萬的患者因嚴重創(chuàng)傷、感染或腫瘤等造成大面積骨缺損，這在很大程度上影響了患者的健康和生存質(zhì)量。目前，用于骨移植的材料主要包括自體骨、同種異體骨以及異種骨[1]，由于這些骨移植物均存在局限性和不足，骨組織工程技術(shù)已成為最有潛力的一種解決方案[2]。骨組織工程技術(shù)的基本方法是將生物材料支架作為生長因子和細胞的載體來誘導成骨, 或從周圍骨組織募集細胞使其原位生長和分化，最終形成新骨[3]。骨組織是承力組織，力學刺激對細胞的成骨誘導分化起著重要作用[4]，因此，通過生物材料支架合理施加和調(diào)節(jié)力學刺激促進骨修復是骨組織工程支架設計的關(guān)鍵。

形狀記憶聚合物（SMPs）的出現(xiàn)為發(fā)展可原位施加力學刺激的力學主動式骨組織工程支架提供了新思路[5]。SMPs 是一類能夠在外界刺激下回復到初始狀態(tài)的智能高分子材料，在回復過程中材料如果與周圍骨組織接觸，就會對骨產(chǎn)生力學刺激，對力學微環(huán)境有很好的仿生效果[6]。此外，SMPs 還具有可實現(xiàn)保形微創(chuàng)植入[7]、控制藥物釋放速率[8]等優(yōu)點，在發(fā)展多功能組織工程支架方面具有較大的應用潛力。但是，SMPs 作為一種形狀記憶材料，與其他形狀記憶材料如形狀記憶合金（SMAs）相比，存在著形狀回復力較弱的問題（回復應力通常小于5 MPa[9]），且一些常見的生物降解聚酯類SMPs 的生物活性不佳、體內(nèi)降解產(chǎn)物呈酸性容易引起無菌炎癥也是廣受關(guān)注的共性問題[10]。

過去通常采取添加超細纖維[11]、碳納米管或碳納米纖維[12]、納米黏土[13]、納米碳化硅[14]、炭黑[15]以及其他無機或有機填料等方式增強SMPs 的動態(tài)、靜態(tài)力學性能。氧化石墨烯（GO）作為一種二維（2D）納米片材料，不僅具有楊氏模量高和易于表面功能化等特點，而且具有可用于細胞附著的活性位點、增強細胞的黏附和增殖[16]等優(yōu)勢，已被用于生物醫(yī)學領域。賴氨酸（Lys）是一種具有生物活性的堿性氨基酸，其分子結(jié)構(gòu)上含有兩個氨基（—NH2）和一個羧基（—COOH），如果將Lys 這種堿性氨基酸和GO 納米增強材料共同引入SMPs，不僅可以增強SMPs 的力學性能，而且可以中和酸性降解產(chǎn)物、緩解炎癥反應和提高SMPs 的生物活性，能為解決一些代表性聚酯類SMPs 的共性問題提供新思路。

乳酸-己內(nèi)酯共聚物（PLCL）是常用的具有形狀記憶特性的組織工程支架構(gòu)建材料[17]。本課題組[18]之前的研究表明，PLCL 基納米纖維膜的形狀記憶轉(zhuǎn)變溫度（即玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg）在38 ℃左右，形狀固定率和形狀回復率均在96%以上，形狀記憶性能良好?；谝陨媳尘?，本文將經(jīng)Lys 功能化后的GO（Lys-GO）通過電紡絲引入到PLCL 纖維中，形成Lys-GO/PLCL 纖維，并通過一系列的材料表征和生物學評價，研究Lys-GO 對具形狀記憶效應的PLCL 纖維膜的力學增強和成骨誘導作用。為此，本文首先研究了GO 對PLCL 纖維膜的力學增強作用，優(yōu)化GO 的添加量并考察其形狀回復力；然后探討了Lys-GO 的引入對所形成的Lys-GO/PLCL 纖維膜的力學增強和酸性降解產(chǎn)物的中和作用；最后通過體外細胞增殖、黏附和礦化實驗評價了Lys-GO/PLCL 的誘導成骨能力。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

PLCL:醫(yī)用級，乳酸與己內(nèi)酯共聚投料物質(zhì)的量之比為90/10，特性黏度為3.6 dL/g，濟南岱罡生物工程有限公司；GO:醫(yī)用級，片徑0.5～5 μm，厚度0.8～1.2 nm，南京先豐納米材料科技有限公司；Lys:醫(yī)用級，國藥集團化學試劑有限公司；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（EDC）:氣相色譜級，上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；六氟異丙醇（HFIP）:分析純，上海達瑞精細品化學有限公司；蛋白酶K（比活3.0～15.0 U/mg）:醫(yī)用級，Sigma 公司；磷酸鹽緩沖劑（PBS）:醫(yī)用級，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司；鼠源骨髓間充質(zhì)干細胞（rBMSCs）:本實驗室自提；胎牛血清（FBS）:細胞培養(yǎng)級，美國Gibco 公司；杜氏改良Eagle 培養(yǎng)基營養(yǎng)混合物F-12（DMEM/F12）培養(yǎng)液:細胞培養(yǎng)級，杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）、堿性磷酸酯酶顯色試劑盒:細胞培養(yǎng)級，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶:細胞培養(yǎng)級，上海邁基生物有限公司；羅丹明-鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）:細胞培養(yǎng)級，美國Invitrogen 公司；4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）:細胞培養(yǎng)級，瑞士Roche 公司；堿性磷酸酶測試盒:細胞培養(yǎng)級，南京建成生物工程研究所；茜素紅染色液:細胞培養(yǎng)級，北京索萊寶科技有限公司；聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）:細胞培養(yǎng)級，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 測試與表征

掃描電子顯微鏡（SEM）:上海復納科學儀器有限公司Phenom XL 型；傅里葉紅外光譜（FT-IR）儀:美國Nicolet 公司NEXUS-670 型；差示掃描量熱（DSC）分析儀:德國耐馳儀器制造有限公司DSC-822 型；X 射線光電子能譜（XPS）儀:日本島津Kratos 公司1/AXIS UltraDLD 型；電子力學測試機:上海恒馭儀器有限公司HY-940FS 型；數(shù)顯拉力計:中國艾普計量儀器有限公司SF-5 型；pH 計:上海精密科學儀器有限公司PHSJ-4A 型；酶標儀:美國Thermo Fisher Scientific 公司MK3 型；倒置熒光顯微鏡:日本Nikon 公司Nikon TI-S 型。

1.3 GO/PLCL 納米纖維膜的制備及性能表征

在常溫下分別按m（GO）∶m（PLCL）為0，0.5%，1%，2%配制紡絲液。為使GO 均勻分散，首先將GO 置于HFIP 中冰浴超聲90 min，然后加入PLCL 攪拌過夜配成PLCL 質(zhì)量濃度為0.10 g/mL 的紡絲液進行電紡絲。PLCL 纖維的紡絲參數(shù)如下:電壓15 kV，注射速率1 mL/h，接收距離15 cm，濕度50%～70%，室溫。GO/PLCL纖維的紡絲參數(shù)為:電壓8～13 kV，接收距離12 cm，其他紡絲條件與PLCL 纖維保持一致。將制備的電紡纖維膜置于真空干燥箱中72 h 以上，以除去殘留溶劑。

通過SEM 觀察各纖維膜的形貌，并用Image J 統(tǒng)計纖維直徑。采用DSC 進行熱分析。采用電子力學測試機進行拉伸力學測試。

采用數(shù)顯拉力計進行回復力測試:先將纖維膜在40 ℃水浴中拉伸30%，0 ℃下固定做塑形處理。然后將纖維膜的一端固定在水浴鍋底部夾子上，另一端固定在數(shù)顯拉力計上。將樣品固定好后，調(diào)節(jié)數(shù)顯拉力計的高度至剛好有示數(shù)。隨后在水浴鍋中加入40 ℃的蒸餾水，記錄拉力計上的數(shù)值并進行統(tǒng)計。

1.4 Lys-GO/PLCL 納米纖維膜的制備及性能表征

1.4.1 Lys 對GO 的化學嫁接 參照文獻[19]的方法對GO 進行Lys 化學嫁接，然后將經(jīng)Lys 接枝的GO 用大量蒸餾水和乙醇離心（3 000 r/min）洗滌3 次，以除去未反應的Lys，室溫下自然干燥得到Lys-GO。通過FT-IR 對Lys-GO 的結(jié)構(gòu)進行表征。采用XPS 檢測Lys-GO 的分峰情況及氮含量。

1.4.2 Lys-GO/PLCL 納米纖維膜的制備與酸度中和作用 Lys-GO/PLCL 納米纖維膜的制備方法同GO/PLCL 膜，m（Lys-GO）∶m（PLCL）=0.5%。對制備的電紡纖維膜在真空干燥箱中進行干燥處理。對GO/PLCL（0.5/100，質(zhì)量比，下文同）和Lys-GO/PLCL（0.5/100）納米纖維膜進行形貌、拉伸力學、形狀回復力等表征。

GO/PLCL 和Lys-GO/PLCL 納米纖維膜降解液的pH 測定方法為:將尺寸為50 mm×50 mm 纖維膜樣品放入離心管中；然后用PBS 配制質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 的蛋白酶K 降解液，每管加入5 mL；最后檢測降解0、12、24、36、48、60 h 后降解液的pH。

1.5 Lys-GO/PLCL 納米纖維膜的成骨誘導作用

1.5.1 支架材料的制備及處理 用經(jīng)干燥處理的玻片接收PLCL、GO/PLCL、Lys-GO/PLCL 這3 種電紡納米纖維，并在真空干燥箱中干燥7 d 以上。之后，將覆有納米纖維膜的玻片置于24 孔板中，紫外照射過夜；放入鋼環(huán)，于酒精中浸泡2 h；吸掉酒精，PBS 洗滌3 次；培養(yǎng)基預培養(yǎng)過夜。

1.5.2 細胞種板 從液氮中取出凍存的rBMSCs（2～4 代），置于37 ℃環(huán)境下進行細胞復蘇并培養(yǎng)2 d 后放在培養(yǎng)箱中消化。消化完成后，取樣10 μL 加入計數(shù)板中計數(shù)，每孔按照2×104個細胞的種植密度和500 μL 的培養(yǎng)基進行種板（24 孔板），每2 d 換液1 次。

1.5.3 體外細胞相容性 細胞增殖:將rBMSCs 分別種植在PLCL、GO/PLCL 及Lys-GO/PLCL 這3 種納米纖維支架上，培養(yǎng)1、4、7 d 后進行檢測（每2 d 換液1 次）。吸掉培養(yǎng)基，加入PBS 清洗3 次，在避光條件下每孔加入400 μL 含10 μL 的CCK-8 培養(yǎng)基，在37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育4 h 后，每孔取樣100 μL加入到96 孔板中，用酶標儀檢測450 nm 處的吸光度（OD）。

熒光染色:將rBMSCs 分別種植在PLCL、GO/PLCL 及Lys-GO/PLCL 這3 種納米纖維支架上，培養(yǎng)4 d 后進行檢測（每2 d 換液1 次）。先吸去培養(yǎng)基，加入PBS 清洗3 次，加入0.04 g/mL 的多聚甲醛固定細胞，30 min后吸去多聚甲醛，再用PBS 清洗3 次。每孔加入400 μL 的Triton X-100（體積分數(shù)0.1%），10 min 后吸除，PBS清洗3 次。避光加入Phalloidin（5 μg/mL），每孔400 μL，染色30 min。然后用PBS 清洗3 次，加入DAPI（1 μg/mL），每孔400 μL，染色15 min 后吸除，PBS 清洗3 次。最后在避光條件下用熒光顯微鏡觀察。

SEM 觀察:將rBMSCs 分別種植在PLCL、GO/PLCL 及Lys-GO/PLCL 這3 種納米纖維支架上，培養(yǎng)7 d后進行檢測（每2 d 換液1 次）。吸去培養(yǎng)基，用PBS 清洗3 次。加入4%多聚甲醛固定細胞30 min。吸掉多聚甲醛，用PBS 清洗3 次。將配制好的梯度酒精（質(zhì)量分數(shù)分別為50%、70%、80%、90%、95%及100%）加入到24 孔板中進行細胞脫水，最后放在干燥箱中干燥，在SEM 下觀察。

1.5.4 體外成骨性能 堿性磷酸酶（ALP）染色:將rBMSCs 分別種植在PLCL、GO/PLCL 及Lys-GO/PLCL 這3 種納米纖維支架上，培養(yǎng)14 d 后進行檢測（每2 d 換液1 次）。吸掉培養(yǎng)基，用PBS 清洗3 次，每孔加入200 μL 0.04 g/mL 的多聚甲醛固定30 min。吸去多聚甲醛，用無菌水洗滌3 次。按照試劑盒說明加入染色工作液（堿性磷酸酯酶顯色緩沖液-氯化硝基四氮唑蘭-5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽混合液（體積比為1∶150∶300），在室溫下避光反應30 min 后觀察顯色情況，無菌水洗滌3 次，在顯微鏡下觀察。

ALP 定量:將rBMSCs 分別種植在PLCL、GO/PLCL 及Lys-GO/PLCL 這3 種納米纖維支架上，培養(yǎng)14 d后進行檢測（每2 d 換液1 次）。吸去培養(yǎng)基，用Triton X-100（體積分數(shù)1%）進行細胞裂解。30 min 后將裂解液移至離心管中離心5 min（1 000 r/min）。取上清液30 μL 加入96 孔板中，無菌水和標準液作為對照組。按照堿性磷酸酶試劑盒說明加入緩沖液和基質(zhì)液（每孔50 μL）后，37 ℃下水浴靜置15 min。最后加入150 μL顯色劑，用酶標儀檢測520 nm 處的吸光度。

茜素紅（ARS）染色:將rBMSCs 分別種植在PLCL、GO/PLCL 及Lys-GO/PLCL 這3 種納米纖維支架上，培養(yǎng)14 d 后進行檢測（每2 d 換液1 次）。吸去培養(yǎng)基，加入PBS 清洗3 次，加入體積分數(shù)60%的異丙醇（每孔200 μL）固定1 min。吸去異丙醇后用無菌水清洗3 次。每孔加入200 μL 的ARS 染色液，室溫下孵育10 min。吸去染色液，用水洗滌至洗液無色，在顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用Origin 8.0 對數(shù)據(jù)進行分析。利用One way ANOVA 進行方差分析，評價樣品之間是否存在顯著性差異（*P＜0.05 為顯著性差異，**P＜0.01 為極顯著性差異）。

2 結(jié)果與討論

2.1 GO 對PLCL 形狀記憶纖維膜的力學增強作用

電紡纖維膜的微納米結(jié)構(gòu)可以促進干細胞向成骨細胞分化，并在植入體內(nèi)后有效促進骨再生[20]。本文通過電紡絲技術(shù)分別制備了PLCL、GO/PLCL（0.5/100）、GO/PLCL（1/100）及GO/PLCL（2/100）4 種超細纖維膜。它們的纖維形貌良好，尺寸均一，纖維細度為670～750 nm（圖1（a）），但隨著GO 的用量增加，纖維表面出現(xiàn)明顯的GO 團聚現(xiàn)象, GO 的不均勻分布對纖維膜的力學性能不利。

PLCL 作為一種可降解形狀記憶聚合物，其形狀記憶轉(zhuǎn)變溫度為Tg[21]。GO 用量對PLCL 纖維膜Tg的影響如圖1（b）所示，純PLCL 納米纖維膜的Tg是40.0 ℃，隨著PLCL 中引入GO 的增加，GO/PLCL 復合納米纖維膜的Tg分別降為39.6、38.6 ℃和38.1 ℃，GO 的引入使該形狀記憶纖維膜的Tg更接近人體溫度，利于其在體溫下實現(xiàn)回復，減少因為利用外源熱刺激實現(xiàn)形狀回復時溫度過高帶來的細胞損傷[22]。圖1（c，d）的力學性能曲線表明，與PLCL 膜相比GO/PLCL（0.5/100）的拉伸強度和楊氏模量均有顯著增加。這是因為在較低的GO 用量下，GO 可以改善其與聚合物基體的界面接觸和相互作用[23]。然而，當GO 的用量繼續(xù)增加時，PLCL 的楊氏模量無明顯變化，但拉伸強度明顯降低。這可能是因為GO 的團聚產(chǎn)生了應力集中點，導致拉伸強度下降。

圖1 納米纖維膜的SEM 照片（a）、DSC 曲線（b）、拉伸應力-應變曲線（c）、拉伸力學性能（d）及形狀回復力（e）Fig.1 SEM images （a）, DSC curves （b）, tensile stress-strain curves （c）, tensile properties （d） and shape recovery stress （e） of the nanofiber films

GO 的引入對PLCL 形狀記憶纖維膜的形狀回復力影響見圖1（e）所示。同樣，GO/PLCL（0.5/100）纖維膜的形狀回復力最佳，比PLCL 膜的形狀回復力提高了28.3%。形狀回復力由大變小再略微變大，說明回復力增強效果與GO 的分散性和用量均有關(guān)，其中使GO 獲得良好分散顯得尤為重要。

2.2 Lys-GO 對PLCL 形狀記憶纖維膜的力學性能影響和降解產(chǎn)物的酸度中和作用

2.2.1 Lys 對GO 的化學嫁接 GO 片層的表面覆蓋有大量含氧官能團，如位于石墨烯片基平面上的環(huán)氧基、羥基和連接在片基平面邊緣的羧基[24]。這些反應位點適合與氨基或羥基反應形成酰胺鍵或酯鍵如圖2（a）所示。FT-IR 分析GO 與Lys 的共價嫁接情況（圖2（b））表明，在GO 的紅外譜圖中有4 個特征峰，即在1 035 cm-1處的C―O―C 拉伸振動峰，1 610 cm-1處的sp2碳骨架結(jié)構(gòu)中C―C 拉伸振動峰，1 724 cm-1處羧基中C―O 的拉伸振動峰以及3 425 cm-1處O―H 的拉伸振動峰[25]。Lys 在2 923 cm-1和1 575 cm-1處存在―CH2和―COO 基團的特征峰。Lys 與GO 嫁接之后，由于酰胺鍵的形成，在1 036 cm-1處形成C―N特征峰，在1 590 cm-1處出現(xiàn)C=O 的寬峰，而3 220 cm-1處的特征峰歸因于N―H 的拉伸振動。這些結(jié)果說明Lys 已經(jīng)成功嫁接到GO 上[26]。

對GO 和Lys-GO 納米片層進行XPS 分析的結(jié)果見圖2（c）?？梢钥吹剑珿O 在285 eV 和534 eV 處出現(xiàn)C1s 和O1s 峰，而Lys-GO 在400 eV 處出現(xiàn)了N1s 峰，表明GO 表面存在氨基，說明GO 與Lys 的確發(fā)生了嫁接[27]。對GO 和Lys-GO 的碳、氧和氮元素的含量統(tǒng)計結(jié)果表明，Lys-GO 的碳氧比是GO 的1.9 倍，這可能是因為在嫁接過程中―COOH 與―NH2反應，形成了酰胺鍵。此外，檢測到Lys-GO 中的氮質(zhì)量分數(shù)為7.12%。

圖2 Lys 與GO 的化學嫁接示意圖（a），Lys-GO 的紅外光譜圖（b）和XPS 譜圖（c）Fig.2 Schematic of the chemical grafting of Lys to GO （a）, FT-IR （b） and XPS spectra（c） of Lys-GO

2.2.2 Lys-GO/PLCL 復合納米纖維膜的力學性能與酸度中和作用 GO/PLCL 與Lys-GO/PLCL 納米纖維膜在室溫（25 ℃）下的拉伸力學性能見圖3（a，b）。從結(jié)果可以看出，與GO/PLCL 膜相比，Lys-GO/PLCL 膜的拉伸強度和楊氏模量等變化不大（性能保留大于85%），但明顯高于未增強的PLCL 膜（圖1（d））。力學性能的略微降低可能是因為Lys 的引入會破壞納米纖維膜的規(guī)整結(jié)構(gòu)，使纖維膜的結(jié)晶度降低，導致拉伸性能降低。

GO/PLCL 與Lys-GO/PLCL 納米纖維膜在40 ℃水浴中的形狀回復力測試結(jié)果見圖3（c），兩者的最大回復力分別為（207.50 ± 28.00） kPa 和（195.00 ± 13.99） kPa，后者的形狀回復力較前者下降了約6%。

在37 ℃下對GO/PLCL 與Lys-GO/PLCL 納米纖維膜同時進行60 h 的酶解降解并檢測降解液的pH 變化，結(jié)果見圖3（d）。可以看出，Lys-GO/PLCL 納米纖維膜降解液的pH 高于GO/PLCL 膜的，并維持在5.2 左右，而GO/PLCL 膜降解液的pH 最終維持在4.2 左右。說明Lys-GO/PLCL 膜在降解過程中對酸性降解產(chǎn)物有一定的中和效果，但仍然偏酸性。

2.3 Lys-GO 對PLCL 形狀記憶纖維膜成骨分化性能的影響

2.3.1 Lys-GO/PLCL 復合納米纖維膜的細胞相容性 rBMSCs 在PLCL、GO/PLCL 與Lys-GO/PLCL 支架上的增殖情況見圖4（a）。從圖中可以看出，rBMSCs 在支架上培養(yǎng)1 d 與4 d 時，3 組rBMSCs 增殖無顯著性差異；到第7 d 時rBMSCs 在Lys-GO/PLCL 與PLCL 支架上的增殖有顯著性差異，說明Lys-GO 的引入可促進rBMSCs 的增殖。

圖3 納米纖維膜的拉伸應力-應變曲線（a），拉伸強度和楊氏模量（b），形狀回復力（c）以及酸度中和效果檢測（d）Fig.3 Tensile stress-strain curves （a）, tensile strength and Young’s modulus （b）, shape recovery stress （c） and acidity neutralizing effect （d）of the nanofiber films

圖4 rBMSCs 在PLCL、GO/PLCL 與Lys-GO/PLCL 支架上的增殖情況（a）、熒光染色圖（t =4 d）（b）、SEM 照片（t =7 d）（c）、ALP 染色和定量統(tǒng)計圖（t =14 d）（d）及ARS 染色圖（t =14 d）（e）Fig.4 Proliferation （a）, Fluorescence staining （t =4 d） （b）, SEM images （t =7 d） （c）, ALP staining images and quantitative measurements（t =14 d） （d） and ARS staining （t =14 d） （e） of rBMSCs cultured on the nanofibrous scaffolds

rBMSCs 在染色4 d 的細胞支架上的鋪展和生長形態(tài)見圖4（b），PLCL 上的rBMSCs 呈團聚態(tài)，GO/PLCL上培養(yǎng)的rBMSCs 形態(tài)有所改善，Lys-GO/PLCL 上培養(yǎng)的rBMSCs 黏附性和伸展性最好，出現(xiàn)了形狀良好的肌動蛋白和絲狀偽足。細胞培養(yǎng)7 d 的支架SEM 形貌觀察見圖4（c），rBMSCs 在Lys-GO/PLCL 支架上的鋪展面積明顯大于在PLCL 和GO/PLCL 上的，且rBMSCs 相互交織，這與支架材料中負載的生物活性成分Lys有關(guān)。這些結(jié)果均說明Lys-GO/PLCL 具有良好的細胞相容性。

2.3.2 Lys-GO/PLCL 復合納米纖維膜的成骨分化性能 ALP 是成骨分化的標志性蛋白，反映干細胞向成骨細胞分化的程度[28]。將rBMSCs 分別種植在PLCL、GO/PLCL 與Lys-GO/PLCL 支架上培養(yǎng)14 d，ALP 分泌情況的染色和定量分析結(jié)果見圖4（d）?？梢钥闯?，GO/PLCL 與Lys-GO/PLCL 支架上的ALP 分泌量明顯高于PLCL，其中以Lys-GO/PLCL 上的ALP 分泌量最多，說明Lys-GO 的引入更能促進細胞ALP 的分泌和成骨分化。

鈣沉積是骨生長中的重要環(huán)節(jié)，也是骨細胞成骨分化的重要標志[29]。本文利用ARS 染色定性檢測rBMSCs 在PLCL、GO/PLCL 與Lys-GO/PLCL 這3 種支架上的鈣沉積情況，評估細胞在這些支架上的成骨礦化能力。rBMSCs 在3 種支架上培養(yǎng)14 d 的鈣沉積結(jié)果見圖4（e），其結(jié)果與ALP 檢測結(jié)果一致，說明Lys-GO 的加入有利于鈣沉積和成骨誘導。

3 結(jié) 論

（1）采用電紡方法制備了纖維膜狀的GO/PLCL 骨組織工程支架，GO/PLCL（0.5/100）纖維膜形貌良好，直徑在700 nm 左右，Tg為39.6 ℃，更接近于人體溫度，與PLCL 支架相比，其楊氏模量提高了28.4%，形狀回復力提高了28.3%。

（2）Lys-GO/PLCL 復合納米纖維膜在基本維持GO/PLCL 纖維膜的力學性能以及形狀記憶性能的基礎上，可有效解決PLCL 存在的降解酸性問題。

（3）Lys-GO/PLCL 支架更有利于rBMSCs 的增殖、鋪展與成骨分化。