• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    聯(lián)合TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫構(gòu)建和分析胃癌中circRNA相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)

    2020-09-24 12:03:50廖苑君孫勝南藍(lán)樹金趙小蕾覃繼恒饒紹奇
    生命科學(xué)研究 2020年4期
    關(guān)鍵詞:子網(wǎng)調(diào)控胃癌

    李 讓,廖苑君,孫勝南,藍(lán)樹金,趙小蕾,覃繼恒,饒紹奇*

    (廣東醫(yī)科大學(xué)a.公共衛(wèi)生學(xué)院;b.醫(yī)學(xué)系統(tǒng)生物學(xué)研究所,中國廣東東莞523808)

    作為嚴(yán)重危害人類健康的消化道惡性腫瘤之一,胃癌的發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中分別處于第5位和第3位[1]。各種治療手段的應(yīng)用使得胃癌患者的5年生存率有所上升,但胃癌晚期患者的預(yù)后仍然較差。目前,胃癌仍是威脅人類健康的復(fù)雜疾病,其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制尚未完全明確。

    競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)的概念由哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院Poliseno等[2]首先提出,其并非一種全新的RNA,而是代表了一種新的基因表達(dá)調(diào)控模式。既往研究表明,微RNA(microRNA,miRNA)通過與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′-untranslated region,3′-UTR)結(jié)合抑制靶mRNA的翻譯,實現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá),從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長、發(fā)育[3]。在ce-RNA的理論假說中,任何擁有miRNA反應(yīng)元件(miRNA response element,MRE)結(jié)構(gòu)的RNA都可以作為ceRNA,包括環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)、長鏈非編碼 RNA(long noncoding RNA,lncRNA)、mRNA和假基因轉(zhuǎn)錄物等。作為ceRNA家族的一員,circRNA同樣能夠通過競爭性地結(jié)合miRNA來調(diào)控基因的表達(dá)[4]。circRNA因5′和3′端通過共價鍵相連而呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)[5],相對于線性RNA,特殊的結(jié)構(gòu)使得circRNA擁有更強(qiáng)的穩(wěn)定性和更高的保守性[6]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展,大量潛在的circRNA被發(fā)現(xiàn),并且被證實作為腫瘤的重要調(diào)節(jié)因子與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)[7~9]。近年來,越來越多的研究表明circRNA在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[10~11]。此外,circ-RNA具有的分布范圍廣、保守性高、組織表達(dá)特異性高等特點,也預(yù)示著其有望成為胃癌診斷的生物標(biāo)志物或胃癌治療的靶點[12~13]。

    基于生物信息學(xué)分析和多數(shù)據(jù)庫的聯(lián)合應(yīng)用,本研究挖掘了胃癌中差異表達(dá)的circRNA、miRNA和mRNA并構(gòu)建了ceRNA網(wǎng)絡(luò);隨后,利用網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩苑治鍪侄?鑒定了核心的circ-RNA并提取了circRNA介導(dǎo)的ceRNA子網(wǎng);最后,以ceRNA機(jī)制為切入點研究了核心circRNA在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制,這為胃癌的診斷與治療提供了潛在靶點,同時也為研究circRNA在胃癌中的作用機(jī)制提供了新的思路。

    1 材料和方法

    1.1 數(shù)據(jù)來源

    從GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫[14]中按照以下標(biāo)準(zhǔn)獲取胃癌的circRNA基因芯片數(shù)據(jù):以“gastric cancer”&“circRNA”為關(guān)鍵詞檢索與胃癌相關(guān)的circRNA基因芯片;選擇物種為“Homo sapiens”、研究類型為“expression profiling by array”兩個過濾條件進(jìn)一步篩選數(shù)據(jù);最后選定實驗設(shè)計符合病例對照研究類型并且病例與對照的組織樣本數(shù)均大于或等于3的芯片。根據(jù)篩選結(jié)果,我們下載了兩套胃癌的circRNA基因芯片:GSE13-1414(包含3個胃癌組織和3個非癌組織)和GSE100170(包含5個胃癌組織和5個非癌組織)。

    作為目前最權(quán)威的癌癥基因信息數(shù)據(jù)庫,TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫[15]覆蓋 33 種癌癥類型,含有超過30 000例的腫瘤樣本以及20 000個基因的表達(dá)信息。本研究利用gdc-client工具從TCGA數(shù)據(jù)庫下載了胃癌的RNA-seq和miRNA-seq數(shù)據(jù),其中RNA-seq數(shù)據(jù)包括30個正常樣本和343個腫瘤樣本,miRNA-seq數(shù)據(jù)包括45個正常樣本、446個腫瘤樣本及406個病人的生存數(shù)據(jù)。

    1.2 差異表達(dá)RNA的篩選

    利用 R 語言(版本 3.5.0)和 Bioconductor平臺中的limma包對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析[16],篩選差異表達(dá)的circRNA(DE-circRNA),納入標(biāo)準(zhǔn)為:P value<0.05,|log2fold change(log2FC)|>1。取 GSE1-31414和GSE100170芯片中差異表達(dá)的circRNA的交集作為最終篩選出來的DE-circRNA。

    對于從TCGA數(shù)據(jù)庫下載的RNA-seq和miRNA-seq數(shù)據(jù),首先去除平均表達(dá)值低于1的mRNA和miRNA,隨后利用edgeR包進(jìn)行差異分析[17],最后通過錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)校正,以 FDR<0.05 同時|log2FC|>1 為標(biāo)準(zhǔn)篩選出差異表達(dá)的miRNA(DE-miRNA)和mRNA(DE-mRNA)。

    1.3 ceRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

    首先,采用CircInteractome數(shù)據(jù)庫預(yù)測DE-circRNA和DE-miRNA的調(diào)控關(guān)系[18],構(gòu)建circ-RNA-miRNA關(guān)系對。隨后,利用miRDB、miRTarBase和TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測DE-miRNA和DE-mRNA的調(diào)控關(guān)系[19],將同時在任意兩個或兩個以上數(shù)據(jù)庫都被預(yù)測到的miRNA-mRNA調(diào)控關(guān)系納入后續(xù)的分析中。最后,基于共享的miRNA構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),并利用 Cytoscape 軟件(版本 3.6.1)對調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化[20]。

    1.4 關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)的提取

    研究表明網(wǎng)絡(luò)中的核心節(jié)點(拓?fù)鋵傩郧?0%~20%)在疾病網(wǎng)絡(luò)中扮演者關(guān)鍵角色[21~22],而這些核心節(jié)點一旦受到破壞,將會影響網(wǎng)絡(luò)的功能,進(jìn)而影響疾病的發(fā)生發(fā)展[22]。本研究利用Cytoscape軟件的NetworkAnalyzer工具對構(gòu)建的ceRNA網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治鯷23],合并度數(shù)(degree)、中介中心性(betweenness centrality)、輻射力(radiality)3種指標(biāo),取網(wǎng)絡(luò)中處于前10%的節(jié)點作為核心節(jié)點,并根據(jù)這些核心節(jié)點從原始的ceRNA網(wǎng)絡(luò)中提取子網(wǎng)。

    1.5 功能富集分析和生存分析

    通過在線網(wǎng)站KOBAS對子網(wǎng)進(jìn)行KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析[24],分析子網(wǎng)行使的生物學(xué)功能。整合來自TCGA數(shù)據(jù)庫中胃癌的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)和生存數(shù)據(jù),使用R語言的survival包對子網(wǎng)進(jìn)行生存分析,以挖掘預(yù)后相關(guān)的基因。

    本研究遵循上述流程開展,技術(shù)路線見圖1。

    2 結(jié)果

    2.1 差異表達(dá)的RNA

    圖1 數(shù)據(jù)獲取及分析流程圖Fig.1 The flow chart of data acquisition and analysis

    芯片數(shù)據(jù)的差異表達(dá)分析結(jié)果顯示,在GSE131414與GSE100170芯片中分別獲得了1 522個和713個差異表達(dá)的circRNA,兩者取交集后得到45個circRNA(圖2A~C)。對于RNA-seq數(shù)據(jù)和miRNA-seq數(shù)據(jù),差異分析后分別獲得了4 610個差異表達(dá)的mRNA和276個差異表達(dá)的miRNA(圖 2D,E)。.

    2.2 原始ceRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

    通過數(shù)據(jù)庫的預(yù)測構(gòu)建了1 538對circ-RNA-miRNA和2 029個miRNA-mRNA關(guān)系對。隨后,基于共享miRNA構(gòu)建了一個包含153對circRNA-miRNA和2 029個miRNA-mRNA關(guān)系對的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖3),其中包含39個circ-RNA、30個miRNA和1 303個mRNA。

    2.3 circRNA介導(dǎo)的ceRNA子網(wǎng)絡(luò)

    對原始ceRNA網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩赃M(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn),3個 circRNA節(jié)點(hsa_circ_0008468、hsa_circ_0005822、hsa_circ_0025842)和 3 個 mi-RNA 節(jié)點(hsa-miR-940、hsa-miR-944、hsa-miR-515-5p)在3種拓?fù)鋵W(xué)指標(biāo)排名中都處于前10%,提示它們?yōu)榫W(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點。根據(jù)3種指標(biāo)對節(jié)點進(jìn)行排序,前10個核心節(jié)點的拓?fù)鋮?shù)見表1。基于鑒定到的6個核心節(jié)點,我們從原始的ceRNA網(wǎng)絡(luò)中提取了子網(wǎng)絡(luò),其中包括3個circ-RNA、3個 miRNA和 501個 mRNA,共有 8對circRNA-miRNA和539個miRNA-mRNA關(guān)系對(圖 4)。

    2.4 子網(wǎng)的功能富集分析

    KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,子網(wǎng)富集于代謝途徑(hsa01100)、cAMP 信號通路(hsa04024)、神經(jīng)活性配體-受體相互作用(hsa04080)、pathways in cancer(hsa05200)等多個有統(tǒng)計學(xué)意義的信號通路(圖 5)。

    2.5 子網(wǎng)的生存分析

    圖2 胃癌中差異表達(dá)的RNA(A)GSE100170芯片中差異表達(dá)的circRNA;(B)GSE131414芯片中差異表達(dá)的circRNA;(C)芯片中差異表達(dá)circRNA的韋恩圖;(D)TCGA數(shù)據(jù)庫中差異表達(dá)的mRNA;(E)TCGA數(shù)據(jù)庫中差異表達(dá)的miRNA。紅色和綠色的點分別代表上調(diào)和下調(diào)的RNA;黑色的點代表變化不顯著或變化倍數(shù)小的RNA。Fig.2 The differentially expressed RNAs in gastric cancer(A)Differentially expressed circRNAs in the GSE100170 chip;(B)Differentially expressed circRNAs in the GSE131414 chip;(C)Venn diagram of differentially expressed circRNAs;(D)Differentially expressed mRNAs in the TCGA database;(E)Differentially expressed miRNAs in the TCGA database.The red and green dots represent up-and down-regulated RNAs,respectively,and black dots represent the RNAs that do not reach the threshold for screening differentially expressed RNAs.

    圖3 胃癌中circRNA介導(dǎo)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)三角形、倒三角和圓形分別代表差異表達(dá)的circRNA、miRNA和mRNA;紅色代表上調(diào),綠色代表下調(diào)。Fig.3 The circRNA-mediated ceRNA network in gastric cancerTriangles,inverted triangles and circles represent DE-circRNA,DE-miRNA and DE-mRNA,respectively.The colors red and green represent up-regulation and down-regulation,respectively.

    表1 原始ceRNA網(wǎng)絡(luò)中排名前10的circRNA和miRNA的拓?fù)鋵傩訲able 1 Topological properties of the top 10 circRNAs and miRNAs in the primary ceRNA network

    生存分析發(fā)現(xiàn)子網(wǎng)中有14個基因與胃癌的預(yù)后顯著相關(guān)(P<0.01)。其中,ACO2、E2F8 的高表達(dá)組相對于低表達(dá)組預(yù)后較好;而GHR、ITIH5、KLHDC8A、NPAS3、PDE2A、PDGFD、PNMA2、RAB9B、RECK、SLC24A2、TMEM55A、TMTC1 的高表達(dá)組相對于低表達(dá)組預(yù)后較差,結(jié)果見圖6。

    3 討論

    圖4 競爭性內(nèi)源RNA子網(wǎng)三角形、倒三角和圓形分別代表差異表達(dá)的circRNA、miRNA和mRNA;紅色代表上調(diào),綠色代表下調(diào)。Fig.4 The ceRNA subnetworkTriangles,inverted triangles and circles represent DE-circRNA,DE-miRNA and DE-mRNA,respectively.The colors red and green represent up-regulation and down-regulation,respectively.

    圖5 KEGG功能富集圖Fig.5 The KEGG functional enrichment diagram

    ceRNA概念的提出將傳統(tǒng)的相互作用模式由“miRNAs→mRNAs”網(wǎng)絡(luò)變成更加多元的“RNAs→miRNAs→mRNAs”復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[25]。在“miRNAs→mRNAs”互作網(wǎng)絡(luò)中,miRNA通過以單個miRNA調(diào)節(jié)多個不同mRNA或以多個不同的miRNA調(diào)節(jié)單個mRNA的方式作用于靶基因3′-UTR區(qū)域,實現(xiàn)對mRNA的降解或功能抑制。ceRNA概念的提出賦予了circRNA等非編碼RNA新的生物學(xué)功能[26],極大地豐富了轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。ceRNA競爭性結(jié)合miRNA,降低miRNA對靶基因mRNA的抑制作用,多種ceRNA、miRNA與mRNA之間的相互作用形成復(fù)雜的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[27],從而參與包括腫瘤發(fā)生發(fā)展在內(nèi)的一系列生物學(xué)過程[28~29]。隨著對circRNA認(rèn)識的不斷加深,circRNA被證實在腫瘤基因表達(dá)中扮演著不可或缺的調(diào)控作用[30],并且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[31]。本研究通過GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫的聯(lián)合應(yīng)用構(gòu)建了胃癌中由circRNA介導(dǎo)的原始ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),并進(jìn)一步通過網(wǎng)絡(luò)分析挖掘了緊密聯(lián)系的核心節(jié)點,提取了關(guān)鍵子網(wǎng)。最后,對關(guān)鍵子網(wǎng)進(jìn)行了功能富集分析,以判斷網(wǎng)絡(luò)行使的生物學(xué)功能;同時,通過生存分析挖掘了與胃癌預(yù)后相關(guān)的基因。

    圖6 ceRNA子網(wǎng)中14個預(yù)后基因的生存曲線Fig.6 The survival curves of 14 prognostic genes in ceRNA subnetwork

    相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),miRNA通過調(diào)控靶基因表達(dá)參與細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲等多種生物學(xué)行為[26]。利用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治?本研究挖掘了3個核心miRNA,分別為 hsa-miR-940、hsa-miR-944、hsamiR-515-5p。通過文獻(xiàn)搜索發(fā)現(xiàn),這3個核心節(jié)點已被報道與胃癌密切相關(guān),例如:Fan等[32]研究表明,hsa-miR-940通過hsa-miR-940/Cbl-b/STAT5a軸上調(diào)PD-L1(programmed death ligand-1)的表達(dá),從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和遷移;Pan等[33]研究證實,hsa-miR-944通過與MACC1(metastasis-associated in colon cancer 1)的 3′-UTR 序列結(jié)合下調(diào)MACC1在胃癌細(xì)胞中的表達(dá),從而抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和胃癌的轉(zhuǎn)移;Wang等[34]報道,hsa-miR-515-5p表達(dá)水平的上升抑制了胃癌的發(fā)生,并與胃癌細(xì)胞的生長和侵襲密切相關(guān)。文獻(xiàn)檢索的結(jié)果不僅證實了從原始ceRNA網(wǎng)絡(luò)中鑒定的3個核心miRNA在胃癌發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色,同時也印證了本文分析方法在網(wǎng)絡(luò)核心節(jié)點的識別方面擁有較高的準(zhǔn)確性。

    通過對ceRNA子網(wǎng)進(jìn)行KEGG信號通路的富集分析,我們發(fā)現(xiàn)子網(wǎng)顯著富集到代謝途徑(hsa01100)、cAMP 信號通路(hsa04024)、神經(jīng)活性配體-受體相互作用(hsa04080)、pathways in cancer(hsa05200)等多個有統(tǒng)計學(xué)意義的信號通路(圖5)。其中,大部分通路已有文獻(xiàn)支持與腫瘤發(fā)生機(jī)制密切相關(guān),如經(jīng)典的PI3K-Akt信號通路,當(dāng)其被酪氨酸激酶受體激活后,磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)催化磷脂酰肌醇4,5-雙磷酸磷酸化為磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸,導(dǎo)致3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(3-phosphoinositide dependent protein kinase 1,PDK1)和蛋白激酶B(protein kinase B,PKB;也稱作Akt)募集到質(zhì)膜并被激活,而后Akt作用于多個下游效應(yīng)因子,影響腫瘤細(xì)胞的生長、增殖和凋亡[35]。另外,Yin等[36]研究表明,嘌呤核苷酸是腫瘤細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)和必要條件,在腫瘤細(xì)胞中嘌呤合成途徑的酶代謝得到了增強(qiáng),而且嘌呤代謝受損與癌癥的發(fā)展有關(guān)。Boroughs等[37]研究報道,癌細(xì)胞的生長和繁殖增加了其對營養(yǎng)物質(zhì)的攝取,而各種代謝途徑可為癌細(xì)胞的生長和增殖提供必要的物質(zhì)支持,其中代謝重編程被認(rèn)為是癌癥的標(biāo)志[38]。以上信息提示,hsa_circ_0008468、hsa_circ_000-5822和hsa_circ_0025842介導(dǎo)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)參與了胃癌發(fā)生發(fā)展的多個生物學(xué)過程。

    在生存分析中我們發(fā)現(xiàn)circRNA介導(dǎo)的子網(wǎng)中存在多個與胃癌預(yù)后相關(guān)的基因(圖6)。而3個核心的circRNA(hsa_circ_0008468、hsa_circ_000-5822、hsa_circ_0025842)可能通過 circRNA-mi-RNA-mRNA調(diào)控軸調(diào)節(jié)這些預(yù)后基因的表達(dá),從而影響胃癌病人的預(yù)后。例如:在hsa_circ_002-5842-hsa-miR-940-ACO2調(diào)控軸中,hsa_circ_002-5842 下調(diào)、hsa-miR-940 上調(diào)、ACO2 下調(diào)(圖 4)。hsa_circ_0025842的低表達(dá)會減弱其對hsa-miR-940的競爭性吸附,使得過量的hsa-miR-940與ACO2結(jié)合,從而使ACO2表達(dá)水平降低。本研究的生存分析結(jié)果(圖6)以及相關(guān)研究[39]都表明,ACO2低表達(dá)的胃癌患者相對于ACO2高表達(dá)的患者擁有較低的生存率。因此,我們推測hsa_circ_0025842的低表達(dá)可能與胃癌病人的不良預(yù)后相關(guān)。又如:在hsa_circ_0005822-hsa-miR-944-SLC24A2調(diào)控軸中,hsa_circ_0005822上調(diào)、hsamiR-944下調(diào)、SLC24A2上調(diào)(圖4)。這說明hsa_circ_0005822的上調(diào)可促進(jìn)SLC24A2的表達(dá),而本文的生存分析結(jié)果顯示SLC24A2高表達(dá)的胃癌患者擁有較低生存率(圖6),提示hsa_circ_000-5822的高表達(dá)與胃癌患者不良預(yù)后相關(guān)。另外,在hsa_circ_0008468-hsa-miR-940-PDE2A調(diào)控軸中,hsa_circ_0008468下調(diào)、hsa-miR-940上調(diào)、PDE2A下調(diào)(圖4),提示hsa_circ_0008468的下調(diào)抑制了PDE2A的表達(dá)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)PDE2A的低表達(dá)會抑制腫瘤細(xì)胞的生長與侵襲[40],同時本研究的生存分析表明PDE2A低表達(dá)的胃癌患者擁有更佳的預(yù)后。因此,我們推測hsa_circ_0008468的低表達(dá)可改善胃癌患者的預(yù)后。綜上所述,在ceRNA網(wǎng)絡(luò)中,3個核心的circRNA可能通過競爭性地結(jié)合miRNA實現(xiàn)對預(yù)后基因的調(diào)控,從而影響胃癌患者的預(yù)后。

    總的來講,本研究通過生物信息學(xué)的方法挖掘了原始ceRNA網(wǎng)絡(luò)中核心的circRNA,并提取了核心circRNA介導(dǎo)的ceRNA子網(wǎng),為circRNA的ceRNA機(jī)制研究提供了參考方向,同時也為胃癌的診斷、治療提供了新的分子靶點。研究過程采用的方法具有普適性和創(chuàng)新性,為后續(xù)深入的實驗性研究提供了基礎(chǔ)。

    猜你喜歡
    子網(wǎng)調(diào)控胃癌
    一種簡單子網(wǎng)劃分方法及教學(xué)案例*
    如何調(diào)控困意
    經(jīng)濟(jì)穩(wěn)中有進(jìn) 調(diào)控托而不舉
    中國外匯(2019年15期)2019-10-14 01:00:34
    子網(wǎng)劃分問題研究及應(yīng)用
    子網(wǎng)劃分的簡易方法
    順勢而導(dǎo) 靈活調(diào)控
    P53及Ki67在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義
    胃癌組織中LKB1和VEGF-C的表達(dá)及其意義
    SUMO修飾在細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用
    胃癌組織中VEGF和ILK的表達(dá)及意義
    日本黄色日本黄色录像| 老汉色av国产亚洲站长工具| 俄罗斯特黄特色一大片| 一区二区日韩欧美中文字幕| 精品亚洲成国产av| 久久精品国产a三级三级三级| 国产一级毛片在线| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 人成视频在线观看免费观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 91精品国产国语对白视频| 男女下面插进去视频免费观看| 男人爽女人下面视频在线观看| 久久国产精品大桥未久av| 老司机亚洲免费影院| 中文字幕人妻丝袜制服| 69精品国产乱码久久久| 999久久久国产精品视频| 大香蕉久久成人网| 十八禁高潮呻吟视频| 欧美精品一区二区免费开放| 精品国产乱码久久久久久男人| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 麻豆av在线久日| bbb黄色大片| 首页视频小说图片口味搜索| 69精品国产乱码久久久| 黄色片一级片一级黄色片| tocl精华| 久9热在线精品视频| 欧美日本中文国产一区发布| av有码第一页| 啪啪无遮挡十八禁网站| 免费在线观看黄色视频的| 2018国产大陆天天弄谢| 久久99热这里只频精品6学生| 一本大道久久a久久精品| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲伊人色综图| 久热这里只有精品99| 国产精品av久久久久免费| 欧美精品一区二区大全| 久久久久国内视频| 久久九九热精品免费| 老司机午夜十八禁免费视频| 欧美一级毛片孕妇| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产人伦9x9x在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 久久久久国内视频| 一级毛片女人18水好多| 99久久人妻综合| 国产成人精品在线电影| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| a级毛片黄视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 亚洲九九香蕉| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲国产精品一区三区| 中文字幕av电影在线播放| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 丝瓜视频免费看黄片| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产男女超爽视频在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 各种免费的搞黄视频| 美女福利国产在线| 黄色 视频免费看| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 在线看a的网站| 日韩大码丰满熟妇| 99久久精品国产亚洲精品| www.熟女人妻精品国产| 国产片内射在线| 极品人妻少妇av视频| 亚洲欧洲日产国产| 久久久久国内视频| 日韩人妻精品一区2区三区| 国产免费av片在线观看野外av| 国产成人免费无遮挡视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 精品少妇黑人巨大在线播放| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲第一青青草原| 少妇 在线观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 啪啪无遮挡十八禁网站| 久久精品国产a三级三级三级| 精品少妇内射三级| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 啦啦啦中文免费视频观看日本| 在线 av 中文字幕| 亚洲精品国产av蜜桃| 老司机靠b影院| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产1区2区3区精品| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 啦啦啦啦在线视频资源| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲精品国产区一区二| 秋霞在线观看毛片| 12—13女人毛片做爰片一| 十八禁高潮呻吟视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| www.av在线官网国产| 亚洲av电影在线进入| 中文字幕人妻丝袜制服| 好男人电影高清在线观看| h视频一区二区三区| 极品少妇高潮喷水抽搐| 丝袜脚勾引网站| 亚洲全国av大片| 1024香蕉在线观看| 宅男免费午夜| 午夜福利一区二区在线看| 国产xxxxx性猛交| 亚洲专区中文字幕在线| 精品久久蜜臀av无| 中国国产av一级| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 99九九在线精品视频| 久久久久久久国产电影| 十八禁网站网址无遮挡| 麻豆av在线久日| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 亚洲欧美清纯卡通| 好男人电影高清在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 超色免费av| 欧美另类一区| 欧美日韩av久久| 欧美亚洲日本最大视频资源| www.自偷自拍.com| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 免费观看a级毛片全部| av又黄又爽大尺度在线免费看| 美女国产高潮福利片在线看| av有码第一页| 欧美少妇被猛烈插入视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲一码二码三码区别大吗| 久久午夜综合久久蜜桃| av在线app专区| cao死你这个sao货| 精品少妇黑人巨大在线播放| 极品人妻少妇av视频| 老司机亚洲免费影院| 亚洲成人国产一区在线观看| 首页视频小说图片口味搜索| 韩国高清视频一区二区三区| 黄频高清免费视频| av国产精品久久久久影院| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 免费在线观看日本一区| 男女无遮挡免费网站观看| 国产精品成人在线| 超碰成人久久| 国产精品.久久久| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲全国av大片| 满18在线观看网站| 青青草视频在线视频观看| 成人国产一区最新在线观看| 日本a在线网址| www.精华液| 天堂俺去俺来也www色官网| 久久久国产精品麻豆| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 色94色欧美一区二区| 人妻久久中文字幕网| 亚洲精品在线美女| 国产伦人伦偷精品视频| 天堂8中文在线网| av天堂在线播放| 亚洲国产欧美一区二区综合| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 精品一品国产午夜福利视频| 一区二区av电影网| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产亚洲精品久久久久5区| 中文字幕最新亚洲高清| 午夜影院在线不卡| 欧美日韩视频精品一区| 成年人午夜在线观看视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 2018国产大陆天天弄谢| 午夜日韩欧美国产| 国产日韩欧美视频二区| 国产精品偷伦视频观看了| 最新的欧美精品一区二区| 精品久久久久久电影网| 久久国产精品人妻蜜桃| 免费在线观看日本一区| 亚洲精品第二区| 天天影视国产精品| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 狂野欧美激情性xxxx| 一二三四在线观看免费中文在| 成人免费观看视频高清| 久久久久久久久免费视频了| 国产亚洲精品第一综合不卡| 男人操女人黄网站| 精品国产乱子伦一区二区三区 | 亚洲成人免费av在线播放| 国产1区2区3区精品| 午夜日韩欧美国产| 日韩 亚洲 欧美在线| 91字幕亚洲| 黄色视频不卡| 99久久精品国产亚洲精品| 在线观看免费高清a一片| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲熟女精品中文字幕| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产一区二区 视频在线| 91九色精品人成在线观看| 成人av一区二区三区在线看 | 久久中文字幕一级| 久久久久视频综合| 天天添夜夜摸| 最近最新免费中文字幕在线| 欧美黄色淫秽网站| 国产成人精品久久二区二区免费| 亚洲三区欧美一区| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产免费福利视频在线观看| 国产区一区二久久| 人妻人人澡人人爽人人| 99国产极品粉嫩在线观看| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 一级片免费观看大全| 亚洲伊人久久精品综合| 中文字幕最新亚洲高清| 男男h啪啪无遮挡| 国产亚洲av高清不卡| 999久久久精品免费观看国产| 悠悠久久av| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产成人精品久久二区二区91| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 亚洲一区中文字幕在线| 午夜影院在线不卡| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲国产日韩一区二区| 黑丝袜美女国产一区| 各种免费的搞黄视频| 下体分泌物呈黄色| kizo精华| 99热国产这里只有精品6| 精品国产国语对白av| 国产成人系列免费观看| 精品福利永久在线观看| 人人澡人人妻人| 999精品在线视频| 免费高清在线观看日韩| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 91精品伊人久久大香线蕉| 日韩视频在线欧美| 中亚洲国语对白在线视频| 一级毛片女人18水好多| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 满18在线观看网站| 9色porny在线观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲国产欧美一区二区综合| 久久久久久久久免费视频了| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 亚洲一码二码三码区别大吗| 久久久久精品国产欧美久久久 | 一级片'在线观看视频| 在线永久观看黄色视频| 人妻 亚洲 视频| 日韩大码丰满熟妇| 丝袜美足系列| 午夜免费观看性视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 日韩中文字幕视频在线看片| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 精品乱码久久久久久99久播| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 日本av手机在线免费观看| 黄色 视频免费看| 久久久水蜜桃国产精品网| 美女主播在线视频| 国产一区二区 视频在线| 国产亚洲一区二区精品| 黄片小视频在线播放| av网站在线播放免费| 丝瓜视频免费看黄片| 波多野结衣一区麻豆| 久久久久国产精品人妻一区二区| 永久免费av网站大全| 久久精品国产综合久久久| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 男女国产视频网站| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产男人的电影天堂91| 欧美在线黄色| 国产男人的电影天堂91| 啦啦啦免费观看视频1| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 在线观看www视频免费| 日韩人妻精品一区2区三区| 国产精品熟女久久久久浪| 一个人免费在线观看的高清视频 | 午夜福利乱码中文字幕| 午夜激情久久久久久久| 久久久国产欧美日韩av| 三级毛片av免费| 欧美 日韩 精品 国产| 国产黄频视频在线观看| 亚洲欧美激情在线| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 成年人午夜在线观看视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 久久久久视频综合| 人妻人人澡人人爽人人| 午夜免费鲁丝| 悠悠久久av| 欧美xxⅹ黑人| av一本久久久久| 我要看黄色一级片免费的| h视频一区二区三区| 免费看十八禁软件| 国产片内射在线| 精品亚洲成国产av| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 在线观看www视频免费| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 久热爱精品视频在线9| 伊人亚洲综合成人网| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 91av网站免费观看| 热99国产精品久久久久久7| 大陆偷拍与自拍| 在线观看免费高清a一片| 亚洲,欧美精品.| 色婷婷av一区二区三区视频| 一区二区三区激情视频| 欧美日韩黄片免| 国产精品一二三区在线看| 日本黄色日本黄色录像| 国产一区二区在线观看av| 亚洲专区字幕在线| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 成人影院久久| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久久国产成人免费| 一区二区三区乱码不卡18| 国产成人精品在线电影| av电影中文网址| 国产男女超爽视频在线观看| 丰满少妇做爰视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人| a 毛片基地| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产精品免费视频内射| 又大又爽又粗| 亚洲精品中文字幕在线视频| 欧美日韩一级在线毛片| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| av线在线观看网站| 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲精品乱久久久久久| av欧美777| 欧美少妇被猛烈插入视频| 久久毛片免费看一区二区三区| 伦理电影免费视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 午夜福利视频精品| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲精品av麻豆狂野| 欧美激情 高清一区二区三区| 桃花免费在线播放| 蜜桃国产av成人99| av超薄肉色丝袜交足视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 久久婷婷成人综合色麻豆| 国产免费av片在线观看野外av| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 哪里可以看免费的av片| 99热这里只有精品一区 | 在线观看日韩欧美| 欧美日本视频| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产1区2区3区精品| 国产一区二区在线观看日韩 | 小说图片视频综合网站| 毛片女人毛片| 国产精品综合久久久久久久免费| 国内精品久久久久久久电影| 精华霜和精华液先用哪个| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 在线观看一区二区三区| 色尼玛亚洲综合影院| 国产精品,欧美在线| 国产成人av激情在线播放| АⅤ资源中文在线天堂| 黑人操中国人逼视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 不卡av一区二区三区| 18禁美女被吸乳视频| 手机成人av网站| 18美女黄网站色大片免费观看| 久久国产精品影院| 久9热在线精品视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产一区在线观看成人免费| 制服人妻中文乱码| 久久香蕉国产精品| 香蕉久久夜色| 一级片免费观看大全| 中文亚洲av片在线观看爽| 桃红色精品国产亚洲av| 国产高清视频在线播放一区| 欧美丝袜亚洲另类 | 亚洲av第一区精品v没综合| 曰老女人黄片| 日韩欧美精品v在线| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| av在线播放免费不卡| 欧美国产日韩亚洲一区| 美女午夜性视频免费| 国产视频内射| 小说图片视频综合网站| 国产精品爽爽va在线观看网站| 级片在线观看| 男女午夜视频在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 啦啦啦免费观看视频1| 欧美日本视频| 久久香蕉国产精品| 成人精品一区二区免费| 久久精品国产亚洲av高清一级| 老司机在亚洲福利影院| 桃红色精品国产亚洲av| www.自偷自拍.com| 99久久精品国产亚洲精品| 嫩草影视91久久| 在线观看日韩欧美| 在线观看66精品国产| 免费看美女性在线毛片视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产熟女午夜一区二区三区| 久久香蕉精品热| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲欧美精品综合一区二区三区| or卡值多少钱| 国产在线精品亚洲第一网站| 久久这里只有精品中国| 欧美3d第一页| 免费看a级黄色片| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 一区二区三区高清视频在线| 99在线视频只有这里精品首页| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 日韩大码丰满熟妇| 韩国av一区二区三区四区| 怎么达到女性高潮| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲欧美激情综合另类| 国产爱豆传媒在线观看 | 亚洲av成人精品一区久久| 国产又色又爽无遮挡免费看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产一区二区三区视频了| 十八禁人妻一区二区| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 99国产综合亚洲精品| 波多野结衣巨乳人妻| 极品教师在线免费播放| 久热爱精品视频在线9| 欧美日韩一级在线毛片| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 一级a爱片免费观看的视频| 国产成人欧美在线观看| √禁漫天堂资源中文www| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲七黄色美女视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 亚洲av成人av| 日本在线视频免费播放| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产成人av教育| 老司机靠b影院| 99久久无色码亚洲精品果冻| 色老头精品视频在线观看| 欧美zozozo另类| 欧美性长视频在线观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产精品亚洲美女久久久| 我要搜黄色片| 国产精品乱码一区二三区的特点| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 日本在线视频免费播放| 神马国产精品三级电影在线观看 | 国产乱人伦免费视频| 听说在线观看完整版免费高清| 日韩大尺度精品在线看网址| 欧美黑人精品巨大| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产97色在线日韩免费| 精品久久久久久,| 成人三级做爰电影| 三级国产精品欧美在线观看 | 欧美黑人巨大hd| 成年版毛片免费区| 亚洲成人久久爱视频| avwww免费| 亚洲精品av麻豆狂野| 日韩av在线大香蕉| 国产精品免费视频内射| 亚洲人成伊人成综合网2020| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 欧美高清成人免费视频www| 一级片免费观看大全| 伊人久久大香线蕉亚洲五| www.精华液| 亚洲中文av在线| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲国产看品久久| 国产精品野战在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| av天堂在线播放| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲人成77777在线视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲欧美日韩东京热| 制服诱惑二区| 日韩精品免费视频一区二区三区| 99热这里只有是精品50| 两个人视频免费观看高清| 亚洲熟女毛片儿| 又爽又黄无遮挡网站| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产精品国产高清国产av| 欧美日韩一级在线毛片| 99久久精品热视频| 亚洲成av人片在线播放无| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲真实伦在线观看| 男女那种视频在线观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 午夜视频精品福利| 国产精品永久免费网站| 国产精品精品国产色婷婷| 成人特级黄色片久久久久久久| 成年免费大片在线观看| 五月玫瑰六月丁香| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 在线观看免费午夜福利视频| 在线永久观看黄色视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 麻豆国产av国片精品| 男人舔女人下体高潮全视频| 成人精品一区二区免费| 高清毛片免费观看视频网站| 一级a爱片免费观看的视频| 国产精品电影一区二区三区| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产男靠女视频免费网站| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲一码二码三码区别大吗| 波多野结衣高清无吗| 久久人妻av系列| 日本a在线网址| 日韩免费av在线播放| 亚洲第一电影网av| 免费看美女性在线毛片视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 欧美中文综合在线视频| 嫩草影院精品99| 日本黄色视频三级网站网址| 精品午夜福利视频在线观看一区| videosex国产| 动漫黄色视频在线观看| 99热这里只有精品一区 | 午夜福利在线观看吧| 亚洲自拍偷在线| 99精品在免费线老司机午夜| 久久精品91无色码中文字幕| 在线视频色国产色| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲国产看品久久| 91在线观看av| 久久久国产成人免费| 精品国产美女av久久久久小说| 不卡av一区二区三区| 午夜激情福利司机影院| 五月玫瑰六月丁香| 一二三四在线观看免费中文在| 狂野欧美激情性xxxx| 九九热线精品视视频播放|