替加環(huán)素/殼聚糖納米粒對堿燒傷角膜新生血管的作用△

馬高陽 蔡巖 李文靜 吳華蓉 王慧嫻 高曉唯

正常角膜無血管，是由于血管生成因子和抗血管生成因子之間保持相對平衡。當(dāng)角膜遭受創(chuàng)傷、炎癥、缺氧及角膜緣干細(xì)胞缺乏等情況時[1]，會打破兩類因子之間的平衡，導(dǎo)致角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)的形成[2]。角膜疾病是世界第三大致盲原因，而發(fā)展中國家角膜化學(xué)燒傷的發(fā)生依然常見，CNV是致盲的主要因素之一，據(jù)統(tǒng)計，每年有140萬人產(chǎn)生CNV，其中12%視力喪失[3-4]。目前臨床治療CNV的方法包括局部應(yīng)用激素、非甾體類抗炎藥、光動力療法、激光光凝術(shù)、細(xì)針透熱法以及結(jié)膜、角膜緣干細(xì)胞和羊膜移植。然而，所有這些方法的療效均有限且會引起許多不良反應(yīng)，尤其是使用類固醇激素后會引起眼壓升高及后囊下白內(nèi)障[5]。所以，抗CNV的新方法亟待研發(fā)。

納米粒具有較大的表面積使物質(zhì)能夠高效、快速并持續(xù)滲透“生物膜”。殼聚糖(chitosan，CS)是甲殼素脫N-乙?；a(chǎn)生的一種多糖，不僅無過敏性和毒性，而且還具有抗菌活性、生物相容性和生物黏附性等。因此，CS在多個行業(yè)中具有潛在的應(yīng)用價值[6]。本研究旨在制備和評估負(fù)載替加環(huán)素(tigecycline，TGC)CS納米粒的特征、細(xì)胞毒性及其抗堿燒傷CNV的作用，并探究其抗新生血管的機制。

1.1 材料

1.1.1 實驗動物新西蘭大白兔46只，體質(zhì)量(2.5±0.5)kg，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗前裂隙燈及眼底鏡檢查排除眼部疾病。

1.1.2 主要儀器及試劑CS(索萊寶 c8320)；TGC(源葉S24031)；LC-20AT型高效液相色譜儀(日本島津)；JEM-1230透射電子顯微鏡(日本JEOL)；YB-6D 型生物組織石蠟包埋機(湖北孝感亞光電子技術(shù)公司)；LEICA RM213型組織切片機(德國)；GelDot-It2系列熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國UVP)。

1.2 方法

1.2.1 TGC/CS納米粒的制備將CS粉末溶于體積分?jǐn)?shù)1%冰醋酸制得1.5 g·L-1的CS溶液后用1 mol·L-1的NaOH調(diào)節(jié)pH值為5.0，恒溫磁力攪拌狀況下逐滴加入1.0 g·L-1的三聚磷酸鈉(Tripolyphosphate，TPP)，使CS與TPP的質(zhì)量比分別為51、41、31、52、21，室溫下10 000 r·min-1攪拌40 min，靜置并觀察混懸液狀態(tài)，最終選定質(zhì)量比為41，即可得到空白CS納米粒。將不同質(zhì)量TGC粉末加入上述1.5 g·L-1的CS溶液，TGC初始濃度分別為0.5 g·L-1、1.0 g·L-1、1.5 g·L-1、2.0 g·L-1、2.5 g·L-1，其余步驟相同，可制得不同初始濃度的TGC/CS納米粒。使用冷凍干燥機將所有納米粒制成凍干粉保存。

1.2.2 TGC/CS納米粒包封率、載藥量的測算精密稱取一定量的凍干粉復(fù)溶后于4 ℃、12 000 r·min-1條件下離心分離30 min，取其上清液通過高效液相色譜(HPLC)法測量其濃度，并計算其包封率及載藥量。進(jìn)行3次實驗取平均值。包封率=包封TGC的量(mg)/體系中TGC的總量(mg)×100%；載藥量=包封TGC的量(mg)/(TGC/CS)納米?？傎|(zhì)量(mg)×100%

1.2.3 TGC/CS納米粒體外釋藥的測算將凍干粉復(fù)溶于1 mL PBS的離心管中，37 ℃水浴條件下持續(xù)振蕩，每隔6 h在4 ℃、12 000 r·min-1條件下離心分離30 min，收集并更換上清液，HPLC法測定其中TGC含量。進(jìn)行3次實驗取平均值。

1.2.4 色譜條件色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(250.0 mm×4.6 mm)，流動相0.1 mol·L-1磷酸氫二銨-三乙胺-甲醇(67132，pH 6.3)，柱溫30 ℃，流速1 mol·mL-1，檢測波長為245 nm 。

1.2.5 TGC/CS納米粒表征、粒徑的檢測將凍干粉用去離子水復(fù)溶后，滴于噴碳銅網(wǎng)(200孔)上，白熾燈下烤干后于透射電鏡下觀察納米粒的形狀、分布并測量其粒子直徑。

1.2.6 TGC/CS納米粒眼表毒性檢測隨機選取6只新西蘭大白兔，右眼為實驗眼，左眼為對照眼。將納米?；鞈乙?0 μL滴于右眼結(jié)膜囊，等量生理鹽水滴于左眼結(jié)膜囊。1 h、6 h、24 h后用裂隙燈觀測角膜、虹膜、結(jié)膜及鞏膜等情況，根據(jù)Draize兔眼刺激實驗評分，即在一側(cè)結(jié)膜囊滴入受試物后在規(guī)定的時間間隔觀察兔眼的刺激及腐蝕程度，并根據(jù)量表對角膜、虹膜及結(jié)膜進(jìn)行量化評分，將所有動物的刺激反應(yīng)評分相加后除以動物數(shù)，即為最終分值。于24 h后戊巴比妥鈉麻醉下空氣栓塞處死，取兩眼的角膜及結(jié)膜行HE染色觀察其形態(tài)及炎癥細(xì)胞的表達(dá)等。

1.2.7 建立堿燒傷模型、分組用藥、裂隙燈觀察并定量計算CNV面積取40只新西蘭大白兔隨機分為TGC/CS納米粒組(A組)、TGC組(B組)、空白CS納米粒組(C組)和生理鹽水對照組(D組)，每組均為10只。兔右眼建立堿燒傷模型，于實驗兔耳緣靜脈注入戊巴比妥鈉并于眼表滴加鹽酸奧布卡因充分麻醉，將浸泡于1 mol·L-1的NaOH溶液中且直徑為6 mm圓形濾紙片置于兔右眼角膜30 s后，用足量生理鹽水沖洗角膜及結(jié)膜囊5 min，左眼不作任何處理。然后A、B、C、D組分別使用TGC/CS納米粒、TGC、CS納米粒、生理鹽水滴右眼，每日2次，共進(jìn)行28 d。使用裂隙燈直接觀察角膜情況，于7 d、14 d、28 d測量各組CNV長度。CNV面積的計算公式：CNV 面積(mm2)=C/12×π×[R2-(R-L)2]，其中C為CNV累及的角膜的圓周鐘點數(shù)，π為圓周率取3.14，L為CNV從角膜緣深入角膜的長度，兔眼的角膜半徑R=7 mm。

1.2.8 組織病理切片HE染色分別于7 d、14 d及28 d時使用戊巴比妥鈉麻醉，空氣栓塞處死各組實驗兔，對取得的角膜組織進(jìn)行福爾馬林溶液固定、石蠟包埋和切片等常規(guī)組織學(xué)方法處理。再對切片進(jìn)行蘇木精和伊紅染色后封片，光鏡觀察角膜結(jié)構(gòu)、新生血管和細(xì)胞浸潤情況等。

1.2.9 Western blot檢測NF-κB、VEGF、MMP-9蛋白的表達(dá)稱取約0.1 mg角膜組織，液氮研磨后加入1000 μL裂解液冰上裂解2 h，檢測各組蛋白含量并配平。低溫高速離心后取上清液等比例加入上樣緩沖液，95 ℃水浴5 min，取上清液上樣，凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。用TBST緩沖液配置50 g·L-1牛血清蛋白(BSA)稀釋抗體原液，4 ℃隔夜孵育一抗，次日室溫下2 h孵育二抗。將電化學(xué)發(fā)光液(ECL)中的A液和B液等比例混合均勻滴注于膜上，分析目的條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析本實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較使用單因素方差分析(ANOVA)。檢驗水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 TGC/CS納米粒表征分析不同初始TGC濃度所得包封率及載藥量的結(jié)果顯示，2 g·L-1時TGC/CS納米粒包封率(67.17±0.29)%與載藥量(59.67±0.29)%最高，因此，選擇該濃度作為TGC的初始濃度制備TGC/CS納米粒。透射電鏡結(jié)果顯示，2 g·L-1的TGC/CS納米粒外觀為光滑球形結(jié)構(gòu)，納米粒間未見粘連，粒徑大小分布均勻，粒徑為(235.84±34.59)nm(見圖1)。

圖1 透射電鏡下TGC/CS納米粒形態(tài)

2.2 TGC/CS納米粒體外釋藥TGC/CS納米粒在體外存在明顯的突釋現(xiàn)象，18 h釋放量約占總量的70%，18～48 h為緩釋狀態(tài)，48 h后藥物幾乎完全釋放(見圖2)。

圖2 TGC/CS納米粒累積釋放TGC曲線

2.3 眼表毒性檢測裂隙燈顯微鏡觀察結(jié)果顯示，各時間點觀察均未見角膜混濁、虹膜異常、結(jié)膜充血水腫、鞏膜異常及分泌物增多等情況，Draize評分為0。HE染色結(jié)果顯示，實驗眼較對照眼的角膜、結(jié)膜未見明顯改變，角膜、結(jié)膜上皮細(xì)胞完整且緊密連接，各層結(jié)構(gòu)清晰，未見水腫及炎細(xì)胞浸潤(見圖3)。

圖3 HE染色下兔實驗眼與對照眼角膜與結(jié)膜組織病理學(xué)觀察(×400)

2.4 角膜大體觀察及CNV面積測量裂隙燈顯微鏡結(jié)果顯示，堿燒傷后前3 d，燒傷區(qū)呈灰白色，邊界清晰、角膜水腫、睫狀充血。堿燒傷后4 d，角膜周邊始見新生血管出現(xiàn)，此時CNV分布稀疏、管徑細(xì)小，各組無明顯差異。堿燒傷后7 d，CNV生長迅速，C、D組CNV分布范圍廣，管徑較粗且頂部出現(xiàn)分叉，A、B組管徑較小，頂部分叉較少，且角膜上皮損傷處基本愈合。堿燒傷后14 d，D組CNV形成較為致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，分布面積進(jìn)一步增大，長度已趨于角膜中央，C組管徑及分布面積小于D組，B組 CNV明顯小于C、D兩組，尤其A組的CNV稀疏細(xì)小。堿燒傷后28 d，各組CNV管徑變細(xì)、面積減小，但C、D組依然大于B組，而A組部分已萎縮消退(見圖4)。角膜堿燒傷后7 d、14 d及28 d，C組CNV面積均小于D組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)，其余各組CNV面積的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)(見表1)。

圖4 各組角膜堿燒傷后7 d、14 d和28 d照片

表1 各組不同時間點CNV面積

2.5 組織學(xué)檢測病理切片HE染色結(jié)果顯示，堿燒傷后7 d各組角膜上皮仍有不同程度缺損，基質(zhì)層水腫，膠原纖維排列疏松且紊亂，炎癥細(xì)胞浸潤，少量新生血管生成，其中C、D兩組炎癥較B組嚴(yán)重，B組較A組嚴(yán)重。堿燒傷后14 d角膜上皮愈合，基質(zhì)淺層潰瘍形成，各層排列基本恢復(fù)正常，C、D兩組見大量新生血管生成，管徑較粗，管腔內(nèi)見紅細(xì)胞，B組炎細(xì)胞、新生血管數(shù)量及管徑均較小，A組最小。堿燒傷后28 d各組角膜上皮完整，基質(zhì)膠原纖維整齊排列，僅見少量炎癥細(xì)胞浸潤，新生血管分布減少，管徑縮小，仍然是C、D兩組炎癥程度最重，B組居中，A組角膜結(jié)構(gòu)接近正常(見圖5)。

2.6 Western blot檢測各組NF-κB、MMP-9、VEGF蛋白相對表達(dá)量A、B、C、D組NF-κB蛋白的相對表達(dá)量分別為0.36±0.01、0.55±0.03、0.77±0.02、0.97±0.03，MMP-9蛋白的相對表達(dá)量依次為0.29±0.02、0.40±0.02、0.53±0.02、0.68±0.01，A、B、C、D組NF-κB與MMP-9蛋白的相對表達(dá)量均依次遞增，差異均有統(tǒng)計學(xué)有意義(均為P<0.05)。A、B、C、D組VEGF蛋白的相對表達(dá)量依次為0.38±0.02、0.45±0.01、0.76±0.02、0.77±0.02，C、D兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其余各組兩兩相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)(見圖6)。

圖5 各組病理切片HE染色結(jié)果(×400)

圖6 Western blot檢測各組NF-κB、MMP-9、VEGF蛋白相對表達(dá)量與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05

3 討論

堿燒傷的早期即可因為角膜組織的壞死及炎癥反應(yīng)導(dǎo)致角膜發(fā)生損傷，損傷的角膜組織在修復(fù)過程中，由于瘢痕化和CNV，致使角膜組織的透明度下降，視力受損[7]。迄今為止，尚未見到國內(nèi)外有文獻(xiàn)報道關(guān)于CNV的特異性治療方式[8]。CNV是一個含有多種炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子參與的病理修復(fù)過程，如 VEGF、MMPs、炎性細(xì)胞因子等均與之相關(guān)，因此，尋找抑制血管生成和炎癥的藥物是治療CNV的重要策略之一[9]。

四環(huán)素是第二代長效非選擇性抗生素，外用可抑制角膜溶解，治療感染性角膜疾病[10]，此外，四環(huán)素及其衍生制品被證明可加速角膜傷口愈合，抑制CNV形成[11]。TGC是四環(huán)素家族中較新較強效的一種制劑，Goktas等[12]首次探討了TGC抑制CNV的療效，發(fā)現(xiàn)局部應(yīng)用TGC后，CNV明顯減少。CS是甲殼素N-脫乙?；a(chǎn)生的一種多糖[13]，殼聚糖及其衍生物具有良好的生物相容性、可溶性和可增強分子在上皮層間的滲透性等優(yōu)勢[14]。納米?？梢蕴岣咚幬飳悄さ拇┩感?、可使藥物在眼表的停留時間延長、延緩藥物降解和代謝以增強藥物的穩(wěn)定性，且納米粒的毒性和副作用低，保質(zhì)期長，是適用于眼科局部給藥的新劑型[15-16]。本研究使用CS納米粒負(fù)載TGC，在發(fā)揮其載體優(yōu)勢的基礎(chǔ)上，尚有如抑菌、止血、抗纖維化、輔助免疫、抗腫瘤和促進(jìn)傷口愈合等CS自身優(yōu)勢[17]。已有研究探討了CS納米粒在角膜堿燒傷方面的應(yīng)用，Roy等[18]合成了以α-平滑肌肌動蛋白抗體為靶點的負(fù)載曲古抑菌素A和顯性負(fù)性Survivin蛋白超小殼聚糖納米粒用于堿燒傷的治療。CS納米粒及其衍生物還廣泛應(yīng)用于其他眼科疾病，如青光眼[19]、眼部感染及炎癥[20]、眼底疾病[21]等。

VEGF是影響內(nèi)皮細(xì)胞生長、存活、通透性、遷移和血管重塑的最重要的促血管生成因子。該因子在組織缺氧狀態(tài)下表達(dá)，并附著在內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體上，誘導(dǎo)上述活動的發(fā)生。VEGF可由內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌[22]。VEGF-A被認(rèn)為是這個家族中最重要的成員，特別是與病理血管生成有關(guān)[5]。VEGF-A是由角膜上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和浸潤性白細(xì)胞分泌的，是炎癥和血管生成的主要介質(zhì)，它破壞血管壁并刺激新血管的生長，在新生血管形成的早期表達(dá)上調(diào)[23-24]。

正常情況下，MMPs、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑和整合素三者處于相對平衡的狀態(tài)。病理性新生血管生成始于這種平衡的破壞，細(xì)胞外基質(zhì)的降解被認(rèn)為是發(fā)展新血管的重要組成部分[25]。MMPs是一類重要的金屬蛋白酶，其中MMP-9也被稱為明膠B，在組織重組和血管生成過程中起關(guān)鍵作用[23]。四環(huán)素及其衍生物可通過抑制MMP-9來增加色素上皮源性生長因子的表達(dá)，從而使得VEGF的表達(dá)下調(diào)，可減少新生血管的形成降低角膜通透性；亦可改善減少瞼板腺功能，從而恢復(fù)淚膜和角膜的光學(xué)質(zhì)量[26]。

NF-κB參與了基因轉(zhuǎn)錄，有文獻(xiàn)報道其參與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡等多種反應(yīng)[27]。NF-κB在轉(zhuǎn)錄水平控制著包括VEGF在內(nèi)的多種促血管生成的因子，可在上游作為靶點控制VEGF的表達(dá)[28]。同時VEGF可以反向上調(diào)NF-κB的表達(dá)從而形成閉合環(huán)路，正反饋增加新生血管的生成[29]。研究報道，MMP-9是NF-κB的基因靶點之一，NF-κB的過度激活會引起MMP-9的表達(dá)增加[30]。本研究已證實TGC可有效抑制NF-κB的表達(dá)。

CNV生成的病理過程分為兩個方面，一是血管生成生長因子依賴的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，另一方面是細(xì)胞外基質(zhì)成分的重構(gòu)和細(xì)胞因子的激活[31]，本實驗中，TGC/CS納米粒被證實可通過抑制NF-κB、VEGF和MMP-9的表達(dá)同時抑制上述兩個方面的病理過程，且TGC/CS納米粒組較游離TGC組抗新生血管能力明顯增強，證實TGC/CS納米粒是防治堿燒傷CNV的潛在用藥。