上調(diào)microRNA-27b對(duì)血小板衍生因子誘導(dǎo)下的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖的抑制作用△

李靜 李迪 李雪穎 寇列玲 車選義

視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)是保護(hù)視網(wǎng)膜光感受器外層和脈絡(luò)膜脈管系統(tǒng)的外屏障[1]，RPE細(xì)胞的異常增殖和遷移是年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR)和增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR)等多種眼部疾病共同的病理基礎(chǔ)[2-4]。microRNA(miRNA)是一類短(19～24個(gè)核苷酸)的非蛋白質(zhì)RNA，通過與目標(biāo)mRNA的3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)結(jié)合，對(duì)轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)產(chǎn)生負(fù)調(diào)控，抑制或降解mRNA[5]。miRNA在復(fù)雜的生理過程(包括炎癥、血管生成、增殖和凋亡)的調(diào)控機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用[6]，前期研究觀察到氧化應(yīng)激下RPE細(xì)胞中的microRNA-27b(miR-27b)下調(diào)[7]，但miR-27b在RPE細(xì)胞增殖中的作用仍未完全清楚。本研究探討在對(duì)血小板衍生因子(platelet-derived growth factor,PDGF)作用下miR-27b對(duì)ARPE-19細(xì)胞增殖的調(diào)控作用，旨在為臨床上與RPE細(xì)胞增殖有關(guān)的眼科疾病的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料ARPE-19細(xì)胞(美國ATCC公司)；DMEM/F12培養(yǎng)液、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、TRIZOL(美國Invitrogen公司)；TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqMan microRNA分析試劑盒(美國Applied Biosystems公司)；抗cyclinD1抗體(CST 2922)、抗CDK4抗體(ab108357)、抗p21CIP1抗體(ab109520)、抗p27KIP1抗體(CST 3686)、內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白(ab8226)(美國Abcam公司)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；miR-27b模擬物、miR-27b陰性對(duì)照(NC)過表達(dá)質(zhì)粒(上海吉瑪制藥技術(shù)公司)；PDGF(美國R&D System公司)； MTT(美國Sigma公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 ARPE-19細(xì)胞培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后，將細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞融合至80%時(shí)進(jìn)行傳代，取3～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞，并使用Lipofectamine 2000試劑將miR-27b模擬物(mimics)、miR-27b NC質(zhì)?；蚩蛰d體轉(zhuǎn)染入ARPE-19細(xì)胞。轉(zhuǎn)染36 h后用重組人PDGF(20 μg·L-1)處理5 h。根據(jù)轉(zhuǎn)染物不同，將實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(control組)、miR-27b陰性對(duì)照組(miR-27b NC組)、miR-27b模擬物轉(zhuǎn)染組(PDGF+mimics組)和空載體轉(zhuǎn)染組(PDGF+NC組)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測使用TRIZOL試劑處理ARPE-19細(xì)胞。 使用TaqMan microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。 使用TaqMan microRNA分析試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-27b表達(dá)水平，使用U6進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。 使用2-△△Ct方法計(jì)算miR-27b相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 MTT檢測細(xì)胞活性將處于對(duì)數(shù)生長期的ARPE-19細(xì)胞，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，以每孔2×103個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，在含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃孵育24 h、48 h、72 h。用miR-27b模擬物或NC轉(zhuǎn)染ARPE-19細(xì)胞36 h后加入PDGF刺激5 h，每孔加入20 μL終濃度為 5 g·L-1MTT溶液并于37 ℃溫育4 h。小心棄上清，每孔加入100 μL裂解液孵育過夜，使結(jié)晶物充分融解；選擇490 nm波長，分光光度計(jì)檢測兩組各孔光密度(D)值，記錄結(jié)果。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期通過流式細(xì)胞術(shù)測定各組的細(xì)胞周期。用PBS洗滌細(xì)胞,1000 r·min-1離心5 min，棄上清液，然后在4 ℃下用體積分?jǐn)?shù)70%冷乙醇再懸浮固定30 min,加入50 g·L-1Rnase A，在37 ℃下孵育1 h，然后在4 ℃避光加入50 μL碘化丙二鈉(PI)溶液染色30 min，通過流式細(xì)胞儀檢測各組的細(xì)胞周期分布情況。

1.2.6 Western blot 檢測各種因子蛋白表達(dá)收集ARPE-19細(xì)胞并在RIPA緩沖液中裂解，然后在4 ℃以14 000 r·min-1離心15 min。上清液的蛋白質(zhì)濃度使用Bradford分析法。轉(zhuǎn)膜，在室溫下用50 g·L-1脫脂牛奶封閉1 h后，將膜與cyclinD1(1500)、CDK4(11000)、p21CIP1(11000)、p27KIP1(11000)和內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白(11000)在4 ℃過夜后漂洗。將膜與辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗(11000)在37 ℃下孵育1 h。用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑檢測蛋白條帶，并用ImageJ系統(tǒng)定量。 β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析(ANOVA)和Bonferroni事后檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測miR-27b表達(dá)水平生長融合至80%～90%的ARPE-19細(xì)胞呈現(xiàn)出與典型鵝卵石形態(tài)一致的天然RPE細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征(圖1A)。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示：經(jīng)PDGF處理5 h，與miR-27b NC組相比，PDGF+NC組miR-27b的表達(dá)顯著降低(P<0.01)；與PDGF+NC組相比，PDGF+mimics組APRE-19細(xì)胞miR-27b表達(dá)增加(P<0.01，圖1B)。

圖1 ARPE-19細(xì)胞形態(tài)及各組miR-27b表達(dá)水平A：ARPE-19細(xì)胞生長至融合狀態(tài)后的形態(tài)學(xué)變化。B：miR-27b相對(duì)表達(dá)量；與 miR-27b NC組相比，**P<0.01 ；與 PDGF+NC組相比，##P<0.01

2.2 MTT法檢測ARPE-19細(xì)胞活性MTT檢測結(jié)果顯示：與miR-27b NC組和空白對(duì)照組相比，PDGF+NC組48 h和72 h APRE-19細(xì)胞的D值均顯著增加(均為P<0.01)；而與PDGF+NC組相比，miR-27b過表達(dá)的PDGF+mimics組 APRE-19細(xì)胞的D值明顯降低(P<0.01)(見圖2)。

圖2 MTT法檢測各組ARPE-19細(xì)胞活性 與miR-27b NC組相比，**P<0.01；與PDGF+NC組相比，##P<0.01

2.3 miR-27b過表達(dá)對(duì)ARPE-19細(xì)胞周期的調(diào)控作用與空白對(duì)照組和miR-27b NC組相比，PDGF+NC組G0/G1期細(xì)胞的百分比顯著降低，S期細(xì)胞的百分比顯著增加(均為P<0.05)；而與PDGF+NC組相比，PDGF+mimics組可顯著增加G0/G1期的細(xì)胞百分比，抑制S期的細(xì)胞百分比，抑制了細(xì)胞增殖(均為P<0.05)(見圖3)。此外，Western blot檢測結(jié)果還顯示：與miR-27b NC組相比，PDGF+NC組cyclinD1蛋白和CDK4蛋白的表達(dá)水平均顯著增加，p21CIP1蛋白和p27KIP1蛋白的表達(dá)均下降(均為P<0.05)；與PDGF+NC組相比，PDGF+mimics組cyclinD1蛋白和CDK4蛋白的表達(dá)均降低，p21CIP1蛋白和p27KIP1蛋白的表達(dá)均增加(均為P<0.05)(見圖4)。

圖3 各組細(xì)胞周期的變化 與miR-27b NC組相比，*P<0.05；與PDGF+NC組相比，#P<0.05

圖4 Western blot檢測各組cyclinD1、CDK4、p21CIP1和p27KIP1蛋白的表達(dá)水平A：蛋白表達(dá)情況。B：定量分析；與miR-27b NC組相比，*P<0.05；與PDGF+NC組相比，#P<0.05

3 討論

正常情況下，RPE細(xì)胞是靜止的，具有不增殖、不遷移和良好的細(xì)胞間通訊連接[8]；病理?xiàng)l件下，RPE細(xì)胞可遷移到玻璃體內(nèi)和視網(wǎng)膜表面，誘發(fā)脈絡(luò)膜或視網(wǎng)膜新生血管膜形成，促進(jìn)PDR和PVR等多種嚴(yán)重視覺損傷疾病的發(fā)生[2,9]。RPE細(xì)胞增殖和遷移涉及多種生長因子和細(xì)胞因子，其中RPE細(xì)胞產(chǎn)生的PDGF已被確定為RPE細(xì)胞增殖的主要有絲分裂原和促細(xì)胞分裂劑，參與各種視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生[10-11]。進(jìn)一步了解PDGF誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)制是非常必要的。

miR-27b是一種內(nèi)含子miRNA，參與多種生物學(xué)過程，包括脂質(zhì)代謝、2型糖尿病和胰島素抵抗，與癌癥也相關(guān)[12-14]。已有研究表明，各種miRNA，如miR-204、miR-211、miR-34a、miR-184和miR-222，參與了眼部疾病中RPE細(xì)胞的增殖和分化[15-16]。本研究中PDGF可增強(qiáng)ARPE-19細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖。PDGF處理后異常增殖的ARPE細(xì)胞中miR-27b表達(dá)也明顯下調(diào)。MTT檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：miR-27b過表達(dá)可使ARPE-19細(xì)胞D值明顯下降，抑制細(xì)胞活性。因此，我們認(rèn)為ARPE-19的異常增殖與miR-27b的下調(diào)可能有關(guān)。同時(shí)，從細(xì)胞周期的G1/G0期到S期的準(zhǔn)確過渡是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵步驟，這主要受有絲分裂信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向標(biāo)志物諸如細(xì)胞周期蛋白(cyclinD1、D2、D3，cyclinE)的刺激，細(xì)胞周期蛋白與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合依賴性激酶(CDK2和CDK4)促進(jìn)細(xì)胞周期向DNA復(fù)制期發(fā)展[17]。 p21CIP1蛋白和p27KIP1蛋白屬于CDK抑制劑的CIP/KIp家族，可滅活細(xì)胞周期蛋白-CDK復(fù)合物并隨后抑制DNA合成[18]。本研究中，miR-27b模擬物轉(zhuǎn)染ARPE-19細(xì)胞，使之過表達(dá)miR-27b，可以顯著抑制PDGF誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞周期從G0/G1到S期的轉(zhuǎn)變，使cyclinD1蛋白和CDK4蛋白的表達(dá)降低，p21CIP1蛋白和p27KIP1蛋白的表達(dá)增加，抑制細(xì)胞增殖。

miR-27b也被發(fā)現(xiàn)參與血管生成。Veliceasa等[19]證明，miR-27b在心臟血管生成中具有促血管生成作用；但也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miR-27b通過靶向VEGF-C抑制胃癌和大腸癌的血管生成[20]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在PDGF刺激下ARPE-19細(xì)胞中miR-27b表達(dá)顯著降低，這可能與血-視網(wǎng)膜屏障的存在、miRNAs的表達(dá)和功能在眼內(nèi)有嚴(yán)格的組織特異性有關(guān)[21]。

綜上所述，在PDGF的誘導(dǎo)下，miR-27b在ARPE-19細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。同時(shí)，miR-27b的過表達(dá)可抑制細(xì)胞活性，調(diào)控細(xì)胞周期，部分抑制了PDGF誘導(dǎo)的ARPE細(xì)胞增殖。因此，miR-27b有可能是抑制ARPE細(xì)胞增殖的潛在候選物，從而為相關(guān)疾病的治療提供新的靶點(diǎn)。 而miR-27b的過表達(dá)對(duì)PDGF誘導(dǎo)下ARPE-19細(xì)胞遷徙能力的影響，靶基因以及信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制將作為我們后續(xù)研究的內(nèi)容。