外源性硫化氫調(diào)節(jié)視神經(jīng)萎縮相關(guān)蛋白1(OPA1)表達(dá)對(duì)視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用△

白雪 羅艷 劉太祥 羅鑫

視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷(retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI)是臨床常見眼病，與神經(jīng)元的丟失、視網(wǎng)膜形態(tài)變異、視網(wǎng)膜功能喪失等有關(guān)，且最終可導(dǎo)致視力喪失[1]。有證據(jù)表明，RIRI在急性青光眼、糖尿病視網(wǎng)膜病變等多種眼部疾病的病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，常因缺乏有效的治療方法而造成視力損害和失明[2-4]。線粒體是調(diào)控細(xì)胞凋亡的核心細(xì)胞器，其能夠分裂、破碎及激活細(xì)胞凋亡[5-6]。其中視神經(jīng)萎縮相關(guān)蛋白1(optic atrophy 1,OPA1)是調(diào)控線粒體分裂和融合的關(guān)鍵分子[7]。OPA1位于線粒體內(nèi)膜間隙、附著于線粒體嵴并參與嵴形態(tài)的調(diào)控[8]。有研究顯示，直接下調(diào)OPA1或OPA1從線粒體內(nèi)膜間隙丟失會(huì)導(dǎo)致線粒體嵴破壞、線粒體破碎，使線粒體外膜去極化并引起CytC釋放、減少細(xì)胞呼吸，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9-10]。硫化氫(H2S)被揭示是一種新型的生物分子，除了一氧化氮和一氧化碳外，也可作為一種內(nèi)源性氣體遞質(zhì)[11-13]。最近一項(xiàng)研究表明，H2S 快速預(yù)處理可介導(dǎo)抗凋亡作用，從而保護(hù)大鼠視網(wǎng)膜免受RIRI[14]。H2S對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用及抑制線粒體CytC釋放與氧化應(yīng)激相關(guān)，但是 H2S保護(hù)線粒體的結(jié)構(gòu)與功能以及抑制CytC的釋放是否與調(diào)控OPA1的分布和表達(dá)有關(guān)尚無(wú)明確定論。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)建立大鼠急性高眼壓模型，探討外源性H2S通過(guò)調(diào)控OPA1表達(dá)與分布對(duì)大鼠RIRI的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器52只健康無(wú)眼疾的10周齡SD雄性大鼠，體質(zhì)量300～350 g，SPF級(jí)，長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供[SCXK(湘)2014-0011]。SD大鼠統(tǒng)一由室溫 20～25 ℃、相對(duì)濕度 50%～65%、滿足光照要求的遵義醫(yī)科大學(xué)SPF 級(jí)動(dòng)物中心喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用均遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物醫(yī)學(xué)倫理?xiàng)l例及國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理保護(hù)條例。一抗：OPA1(兔來(lái)源，美國(guó)Abcam公司)；二抗：羊抗兔IgG(美國(guó)Sigma公司)；內(nèi)參一抗：GAPDH、COX IV(美國(guó)Abcam公司)；硫氫化鈉(NaHS,美國(guó)Sigma公司)；TUNEL試劑盒(瑞士Roche公司)。顯微手術(shù)器械(美國(guó)Alcon 公司)，切片機(jī)(RM2235)(德國(guó)Leica公司)，透射電鏡H-7650(日本Hitachi公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)儀(加拿大Funglyn Biotech公司)。

1.2 動(dòng)物模型的建立參照文獻(xiàn)[15-16]，用前房加壓法制作大鼠急性高眼壓模型。將SD雄性大鼠稱體質(zhì)量后，將100 g·L-1水合氯醛按照3 mL·kg-1體質(zhì)量腹腔內(nèi)注射麻醉。隨機(jī)取每只大鼠任意一眼造模，用4號(hào)半頭皮針(連接有500 mL生理鹽水輸液瓶)沿大鼠顳側(cè)的角鞏膜緣穿刺入前房。輸液瓶高度與實(shí)驗(yàn)眼的垂直距離為176.6 cm，此時(shí)眼壓為120 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg)，可以看見球結(jié)膜、虹膜迅速變白，瞳孔區(qū)橘紅色反光轉(zhuǎn)為蒼白，視網(wǎng)膜蒼白，說(shuō)明已將視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈的供血完全阻斷。高眼壓狀態(tài)持續(xù)1 h后，緩慢將輸液瓶高度降低至眼球水平，眼壓也同時(shí)逐漸降低，拔出針頭，球結(jié)膜和虹膜顏色快速恢復(fù)正常，可見暗紅色瞳孔區(qū)的反光，眼底鏡檢查見視網(wǎng)膜呈現(xiàn)橘紅色，受阻的血管得以重新開放，提示大鼠RIRI模型造模成功。術(shù)畢實(shí)驗(yàn)眼結(jié)膜囊涂妥布霉素眼膏。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及NaHS干預(yù)用數(shù)字表法將所有大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(4只)、RIRI組(24只)及NaHS干預(yù)組(24只)。后兩組再各自分為造模后 1 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)(n=4)。所用NaHS劑量和給藥方法根據(jù)文獻(xiàn)[17-18]設(shè)定。NaHS干預(yù)組分別按大鼠不同體質(zhì)量腹腔內(nèi)注射NaHS液(50 μmol·kg-1，每次使用前均新鮮配制)，連續(xù) 5 d，造模前15 min再次給藥；正常對(duì)照組和RIRI組同方法同時(shí)給予生理鹽水1 mL·kg-1。隨機(jī)取一眼作為實(shí)驗(yàn)眼。

1.4 TUNEL法測(cè)定細(xì)胞凋亡分別取對(duì)照組、RIRI組和NaHS組造模后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠各1只，常規(guī)方法在相應(yīng)時(shí)間摘除大鼠眼球并固定，沿視神經(jīng)長(zhǎng)軸經(jīng)視神經(jīng)做縱切面石蠟切片。視網(wǎng)膜切片常規(guī)脫蠟水化，PBS漂洗，蛋白酶K 21～37 ℃孵育15～30 min，PBS漂洗2次后，檢測(cè)樣本和陽(yáng)性對(duì)照樣本，加入適量凋亡反應(yīng)混合物(50 μL)；陰性對(duì)照樣本加入標(biāo)記溶液，37 ℃濕盒避光孵育60 min，PBS漂洗3次，DAPI染核，PBS漂洗，封片熒光顯微鏡觀察，激發(fā)波長(zhǎng)450～500 nm(488 nm)。每個(gè)視網(wǎng)膜切片選取10個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)分析。

1.5 qPCR檢測(cè)視網(wǎng)膜中OPA1 mRNA表達(dá)分別取各組大鼠，每組及相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)各1只。RNAiso Plus提取各組大鼠視網(wǎng)膜總RNA，經(jīng)純度鑒定和濃度測(cè)定后取1 μg總RNA，兩步法RT反應(yīng)合成cDNA(30 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min，85 ℃ 10 min)。按說(shuō)明書進(jìn)行qPCR(20 μL體系：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 32 s，共40個(gè)循環(huán))。以β-actin為內(nèi)參，以2-△△Ct計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)標(biāo)本設(shè)置3管重復(fù)，取3次的平均值計(jì)算各組大鼠視網(wǎng)膜中OPA1 mRNA的相對(duì)表達(dá)。

1.6 Western blot檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜中細(xì)胞質(zhì)以及線粒體中OPA1、CytC蛋白的表達(dá)摘取各組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)大鼠眼球各1只，完整分離視網(wǎng)膜組織，勻漿后離心，沉淀為細(xì)胞線粒體，再次離心上清液后取出，即為去除線粒體的細(xì)胞質(zhì)蛋白。分別進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳；轉(zhuǎn)膜，漂洗，封閉，漂洗，孵育，漂洗。電化學(xué)發(fā)光法顯色發(fā)光、膠片曝光。應(yīng)用圖像分析軟件Image J對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析，分別以GAPDH、COX IV為內(nèi)參，分別計(jì)算各組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞的線粒體和細(xì)胞質(zhì)中OPA1、CytC蛋白與內(nèi)參的灰度比值。

1.7 透射電鏡觀察線粒體形態(tài)分別取對(duì)照組及RIRI組和NaHS干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)大鼠各1只，深度麻醉，經(jīng)左心室快速灌注 4 ℃ 預(yù)冷的生理鹽水，隨即灌入體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛快速滴注至大鼠四肢抽搐，待抽搐停止后，緩慢滴注20 min后取視網(wǎng)膜組織塊，置于體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛中固定2 h，漂洗，10 g·L-1鋨酸4 ℃固定2 h，脫水，浸透，包埋，聚合，超薄切片厚60 nm，染色，透射電鏡下觀察、拍照。每例標(biāo)本檢測(cè)10個(gè)視野。

2 結(jié)果

2.1 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果與對(duì)照組相比，NaHS干預(yù)組造模后1 h細(xì)胞凋亡未見明顯增多，熒光無(wú)明顯增強(qiáng)，RIRI組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)、NaHS干預(yù)組余時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡增多，熒光明顯增強(qiáng)，NaHS干預(yù)組細(xì)胞凋亡趨勢(shì)同RIRI組，但各個(gè)時(shí)間點(diǎn)凋亡指數(shù)均較RIRI組顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(見表1)。

表1 各組造模后不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡指數(shù)

2.2 qPCR檢測(cè)視網(wǎng)膜中OPA1 mRNA表達(dá)NaHS干預(yù)組和RIRI組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)OPA1 mRNA表達(dá)均較對(duì)照組有所下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。與RIRI組同一時(shí)間點(diǎn)比較，NaHS干預(yù)組除造模后1 h時(shí)OPA1 mRNA 表達(dá)低于RIRI組外，余時(shí)間點(diǎn)OPA1 mRNA表達(dá)均高于RIRI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(見表2)。

2.3 OPA1和CytC的蛋白表達(dá)量RIRI組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)線粒體內(nèi)OPA1和CytC的蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比，呈逐漸下降的趨勢(shì)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；NaHS干預(yù)組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)線粒體內(nèi)OPA1和CytC的蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比，呈現(xiàn)造模后1 h大幅度降低，隨后緩慢回升的趨勢(shì)，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；NaHS干預(yù)組與RIRI組同一時(shí)間點(diǎn)比較，從造模后24 h開始NaHS干預(yù)組OPA1和CytC蛋白表達(dá)均高于RIRI組，除造模后12 h差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P=0.091、0.074)，其余各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，兩組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)和對(duì)照組相比，均呈逐漸增加的趨勢(shì)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。與RIRI組同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)比，NaHS干預(yù)組OPA1和CytC蛋白表達(dá)均較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(見圖1和圖2)。

表2 造模后不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠視網(wǎng)膜中OPA1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量

圖1 OPA1和CytC蛋白在線粒體和胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)灰度圖

圖2 OPA1和CytC蛋白在線粒體和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)相對(duì)表達(dá)量 注:與對(duì)照組比較，*P<0.05；與RIRI組同一時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05

2.4 透射電鏡觀察線粒體形態(tài)與對(duì)照組(線粒體嵴清晰)比較，RIRI組隨時(shí)間延長(zhǎng)線粒體損傷加重，線粒體腫脹，可見細(xì)胞質(zhì)空泡及自噬小體(造模后24 h最為明顯)；NaHS干預(yù)組隨時(shí)間延長(zhǎng)線粒體損傷加重，線粒體腫脹，可見細(xì)胞質(zhì)空泡及自噬小體；NaHS干預(yù)組與RIRI組比較，各時(shí)間點(diǎn)線粒體損傷減輕(見圖3至圖5)。

圖3 對(duì)照組線粒體嵴形態(tài)(×40 000) 紅色箭頭表示線粒體

圖4 RIRI組各時(shí)間點(diǎn)線粒體損傷情況(×40 000) A:RIRI組造模后1 h：大量由線粒體和(或)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹形成的細(xì)胞質(zhì)空泡；B:RIRI組造模后6 h：線粒體嵴消失，成空泡；C:RIRI組造模后12 h：細(xì)胞質(zhì)空泡化明顯，自噬小體形成； D:RIRI組造模后24 h：大量由線粒體和(或)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹形成的細(xì)胞質(zhì)空泡； E:RIRI組造模后48 h：吞噬泡形成，線粒體漸近性腫脹；F:RIRI組造模后72 h：自噬小體形成。藍(lán)色箭頭表示細(xì)胞質(zhì)空泡，綠色箭頭表示自噬小體，紫色箭頭表示吞噬泡

圖5 NaHS干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)線粒體損傷(×40 000) A:NaHS組干預(yù)1 h后：線粒體輕腫脹，結(jié)構(gòu)尚完整 ；B:NaHS組干預(yù)6 h后：線粒體漸進(jìn)性腫脹,線粒體嵴出現(xiàn)擴(kuò)張；C:NaHS組干預(yù)12 h后：線粒體漸進(jìn)性腫脹,線粒體嵴出現(xiàn)擴(kuò)張； D:NaHS組干預(yù)24 h后:線粒體嵴模糊、擴(kuò)張； E:NaHS組干預(yù)48 h后:自噬體形成；F:NaHS組干預(yù)72 h后:線粒體和(或)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹形成的細(xì)胞質(zhì)空泡。紅色箭頭表示線粒體，藍(lán)色箭頭表示細(xì)胞質(zhì)空泡，綠色箭頭表示自噬小體

3 討論

RIRI是指當(dāng)視網(wǎng)膜組織缺血、缺氧，而恢復(fù)血液供氧后，反而加重視網(wǎng)膜的損傷，是一種公認(rèn)的視網(wǎng)膜血管阻塞性疾病[19]。RIRI的形成機(jī)制仍不明確,可能與線粒體功能障礙、視網(wǎng)膜缺血、氧化應(yīng)激、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化等有關(guān)[20-25]，RIRI可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死而最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[26]。H2S 在神經(jīng)元細(xì)胞、微膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的病理生理過(guò)程的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[27-29]，給予NaHS(H2S供體)干預(yù)后，可能通過(guò)抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等途徑改善線粒體功能，從而進(jìn)一步改善神經(jīng)退行性病變[30-31]。有實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，RIRI前通過(guò)H2S預(yù)處理可經(jīng)過(guò)抗凋亡反應(yīng)觸發(fā)神經(jīng)元保護(hù)作用[14]。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示在RIRI組中視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡隨時(shí)間變化逐漸增多，同時(shí)經(jīng)過(guò)NaHS的預(yù)處理，在NaHS干預(yù)組中細(xì)胞凋亡與RIRI組比較均明顯降低，說(shuō)明外源性的H2S可以改善視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞的存活能力，這與以往的研究結(jié)果相符合[32]。但H2S是通過(guò)什么途徑保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的凋亡目前仍不得而知。

線粒體釋放CytC是細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵，而與其有重要關(guān)系的一類蛋白被稱為線粒體塑形蛋白家族，該家族的重要成員之一是OPA1，其位于線粒體的內(nèi)膜及膜間隙，介導(dǎo)線粒體融合，是控制CytC釋放的重要環(huán)節(jié)。OPA1在細(xì)胞中表達(dá)增加，其可以通過(guò)穩(wěn)定線粒體嵴、阻止CytC釋放而減輕細(xì)胞凋亡[33]。本研究結(jié)果顯示，OPA1在RIRI組表達(dá)逐漸降低，經(jīng)過(guò)NaHS預(yù)處理后可增加OPA1表達(dá)。而在Western blot測(cè)定OPA1及CytC的蛋白表達(dá)時(shí)，我們同樣也發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，與RIRI組比較，NaHS干預(yù)組線粒體內(nèi)OPA1及CytC蛋白表達(dá)是逐漸增加的，而在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，NaHS干預(yù)組與RIRI組同一時(shí)間點(diǎn)比較，OPA1及CytC蛋白表達(dá)是降低的，遠(yuǎn)不如RIRI組增加明顯，同時(shí)這些研究結(jié)果也說(shuō)明，NaHS預(yù)處理后可以增加RIRI后總的OPA1表達(dá)水平以及線粒體內(nèi)OPA1和CytC的表達(dá)，減少視網(wǎng)膜的細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)視網(wǎng)膜的神經(jīng)損傷。

線粒體是調(diào)控細(xì)胞凋亡的核心細(xì)胞器，線粒體分裂、破碎激活細(xì)胞凋亡[6-7]。本課題組前期體外實(shí)驗(yàn)也提示NaHS預(yù)處理后線粒體的腫脹明顯減輕[34]。本研究從透射電鏡觀察線粒體形態(tài)發(fā)現(xiàn)，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，RIRI組隨時(shí)間延長(zhǎng)線粒體腫脹明顯、線粒體破裂，在造模后24 h最為嚴(yán)重，加入NaHS以后前24 h線粒體腫脹仍明顯，然后隨時(shí)間延長(zhǎng)損傷減輕，但任何時(shí)間點(diǎn)都比RIRI組的損傷輕。說(shuō)明H2S對(duì)RIRI引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞線粒體損傷有保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在NaHS的干預(yù)下，RIRI后細(xì)胞內(nèi)OPA1表達(dá)增加、OPA1在線粒體內(nèi)外分布與對(duì)照組接近，使線粒體的損傷減輕，細(xì)胞凋亡減少，從而減輕了視網(wǎng)膜的神經(jīng)損傷。但是，在本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，NaHS干預(yù)后早期可以減少細(xì)胞凋亡，而OPA1表達(dá)卻下降(尤其是造模后1 h)，考慮可能為造模后早期外源性H2S抑制細(xì)胞凋亡并非通過(guò)調(diào)節(jié)OPA1的表達(dá)與分布，而是通過(guò)另外的途徑發(fā)揮作用；同時(shí)造模后早期細(xì)胞內(nèi)H2S濃度較高，可能抑制了線粒體呼吸作用，產(chǎn)生細(xì)胞毒性[35]，從而可能影響了OPA1在線粒體內(nèi)外的分布和表達(dá)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，H2S可能通過(guò)調(diào)控OPA1的表達(dá)與分布抑制RIRI，且發(fā)揮保護(hù)作用的時(shí)間是在造模后24 h。本研究結(jié)果為H2S的視網(wǎng)膜細(xì)胞保護(hù)作用提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為H2S的藥物劑型及給藥時(shí)間提供了一定的參考，具有重要的理論意義和臨床實(shí)用價(jià)值。

致謝：感謝貴州細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州麻醉與器官保護(hù)研究中心和遵義醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的支持和幫助！