響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合乳酸菌發(fā)酵梨汁工藝

黃瀅潔,陳笑言,馮龍斐,梁新紅,冉軍艦,焦凌霞

（河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

皇冠梨營養(yǎng)豐富,富含蛋白質(zhì)、脂肪、維生素B、維生素C、蘋果酸、膳食纖維等人體必需的物質(zhì),具有有潤肺、止咳、清熱、降火等功效[1].皇冠梨一般作為初級農(nóng)產(chǎn)品直接銷售,但因果實儲藏、運輸?shù)犬a(chǎn)生了一系列成本,導(dǎo)致了皇冠梨的經(jīng)濟效益降低.皇冠梨不僅營養(yǎng)豐富,并且具有皮薄、果核小、可食率較高,肉嫩多汁的特點,比較適用于加工發(fā)酵果汁飲料[2].

乳酸菌是一類早期廣泛用來發(fā)酵乳制品的益生菌,具有促進食物消化,提高人體免疫力,延緩人體衰老,維持腸道微生物生態(tài)平衡等功能[3-6].目前,乳制品益生菌已經(jīng)以不同的形式進行商業(yè)化生產(chǎn),但過敏和乳糖不耐受是影響乳制品益生菌的主要因素, 而風(fēng)味和清爽性是果汁等非乳制品飲料的主要優(yōu)點[7],因此,乳酸菌發(fā)酵果蔬汁是近年來最受關(guān)注的益生菌飲品[8-10].Chandrakant 等[11]應(yīng)用嗜酸乳桿菌發(fā)酵梨汁時發(fā)現(xiàn),發(fā)酵過程中α-葡萄糖苷酶的抑制活性顯著上升,表明發(fā)酵梨汁具有抗高血糖的作用；Cagno 等[12]的研究表明乳酸發(fā)酵可以提高果汁的抗氧化性能和改善其感官特性.乳酸菌發(fā)酵對保護果蔬汁色澤、預(yù)防褐變有很好的效果,盧嘉懿等[13]應(yīng)用植物乳桿菌發(fā)酵蜜梨,研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌的發(fā)酵作用可有效降低梨汁褐變程度.乳酸菌發(fā)酵果蔬汁后活菌數(shù)較高,Liao[14]等利用內(nèi)生腸膜明串珠菌發(fā)酵芒果汁,在4 ℃下放置30 d 后,活菌數(shù)達6.46×109cfu/mL.有關(guān)乳酸菌發(fā)酵果蔬汁的工藝亦有報道,崔莉等[15]利用植物乳桿菌和腸膜明串珠菌按1:2 混合后發(fā)酵黃秋葵汁,優(yōu)化條件為發(fā)酵時間35 ℃、發(fā)酵時間72 h 和接種量5%,活菌數(shù)達108cfu/mL.劉磊等[16]采用馴化法將嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌按1:1 混合接入龍眼汁中,由響應(yīng)面優(yōu)化法得到最優(yōu)工藝條件為發(fā)酵時間12 h、發(fā)酵溫度45 ℃、脫脂奶粉添加量5%、接種量3%.在該條件下,龍眼果漿的酸度由發(fā)酵前的9.5°T 升為105.1°T.

本試驗以皇冠梨為主要原材料,應(yīng)用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）協(xié)同發(fā)酵梨汁,探討不同菌種比例、接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度對梨汁活菌數(shù)和感官評分的影響,在單因素的基礎(chǔ)上進行響應(yīng)面團的優(yōu)化試驗.旨在研制出一種具有較高活菌數(shù)和感官評分的發(fā)酵梨汁.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

皇冠梨,產(chǎn)于甘肅武威,采摘后儲存于4 ℃冰箱中,大小較均一,顏色淡黃,無機械損傷.

L.plantarum 和L.acidophillus,購于中科院微生物保藏中心,保存于河南科技學(xué)院食品學(xué)院食品研究所.

1.2 儀器與設(shè)備

JYZ—E5V 型原汁機,九陽股份有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器,上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；SW-CJ-1D 垂直凈化工作臺,蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司.

1.3 試驗方法

1.3.1 梨汁的制備 挑選→清洗→去皮去核→切塊→護色（將切塊的梨用1 mol/L 的檸檬酸溶液浸泡護色）→榨汁→過濾（尼龍篩網(wǎng)200 目過濾,取澄清汁）→調(diào)酸（用NaHCO3將果汁pH 值調(diào)至4.0）→添加蔗糖→分裝→滅菌（100 ℃水浴15 min）→冷藏待用.

制得的梨汁pH 值為4.0,糖含量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24.7%.

1.3.2 乳酸菌菌種馴化 菌種馴化過程參考文獻[17],根據(jù)具體試驗略有改動,具體流程為：

菌種→牛奶梨汁混合物（V牛奶:V梨汁=9:1）→37 ℃培養(yǎng)24 h→第一次馴化菌種→牛奶梨汁混合物（V牛奶:V梨汁=8:2）→37 ℃培養(yǎng) 24 h→第二次馴化菌種→牛奶梨汁混合物（V牛奶:V梨汁=6:4）→37 ℃培養(yǎng)24 h→第三次馴化菌種→牛奶梨汁混合物（V牛奶:V梨汁=4:6）→37 ℃培養(yǎng)24 h→第四次馴化菌種→牛奶梨汁混合物（V牛奶:V梨汁=2:8）→37 ℃培養(yǎng) 24 h→第五次馴化菌種→牛奶梨汁混合物（V牛奶:V梨汁=1:9）→37 ℃培養(yǎng)24 h→馴化菌種→純梨汁.

1.3.3 梨汁的發(fā)酵 將L.plantarum 和L.acidophillus 按要求分別或混合接種到梨汁中,在設(shè)定溫度下靜置發(fā)酵一定的時間,測定活菌數(shù)并進行感官評定.

1.3.4 發(fā)酵梨汁活菌數(shù)測定 活菌數(shù)按稀釋涂布平板法計數(shù)[18].

1.3.5 單因素試驗設(shè)計

1.3.5.1 菌種比例對發(fā)酵梨汁的影響 在一定的發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和菌種接種量下,將L.plantarum 和L.acidophillus 按照體積比1:0、1:1、0:1 的菌種比例接入梨汁中,測定不同菌種比例對發(fā)酵梨汁活菌數(shù)和感官評分的影響.

1.3.5.2 發(fā)酵溫度的確定 在一定的發(fā)酵時間和菌種接種量下,按照1.3.5.1 得出的最佳菌種比例,將L.plantarum 和 L.acidophillus 接入梨汁中,分別在 33、35、37、39、41 ℃下發(fā)酵,測定不同發(fā)酵時間對發(fā)酵梨汁活菌數(shù)和感官評分的影響.

1.3.5.3 發(fā)酵時間的確定 在一定的發(fā)酵溫度和菌種接種量下,按照1.3.5.1 得出的最佳菌種比例,將L.plantarum 和 L.acidophillus 接入梨汁中,分別發(fā)酵 18、21、24、27、30 h,測定不同發(fā)酵時間對發(fā)酵梨汁活菌數(shù)和感官評分的影響.

1.3.5.4 菌種接種量的確定 在一定的發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間下,按照1.3.5.1 得出的最佳菌種比例,將L.plantarum 和L.acidophillus 接入梨汁中,在菌種接種量體積分?jǐn)?shù)分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%下發(fā)酵,測定不同菌種接種量對發(fā)酵梨汁活菌數(shù)和感官評分的影響.

1.3.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計 依據(jù)單因素試驗結(jié)果,選取發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量3 個因素進行Box-Behnken 試驗設(shè)計[19].

1.3.7 發(fā)酵梨汁感官評定 發(fā)酵梨汁感官評定由20 名專業(yè)的老師和同學(xué)組成,從顏色、香氣、形態(tài)和口感4 個方面對各個梨汁樣品進行品評分析,評定細則見表1[20].

表1 發(fā)酵梨汁的感官評分Tab.1 Sensory evaluation results of fermented pear juice

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

每組試驗重復(fù)3 次, 以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示；單因素方差分析采用SPSS Satistics19.0 軟件；Duncan 新復(fù)極差法進行顯著性檢驗,以P<0.05 為顯著性檢驗標(biāo)準(zhǔn).

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵梨汁的單因素試驗

2.1.1 菌種比例對發(fā)酵梨汁的影響 不同菌種比例對發(fā)酵梨汁活菌數(shù)和感官評分的影響結(jié)果見圖1.

圖1 菌種比例對活菌數(shù)和感官評分的影響Fig.1 Effect of strain ratio on viable count and sensory evaluation

由圖1 可知,梨汁的活菌數(shù)在L.plantarum 和L.acidophillus 體積比為1:1 時達到最大值,其值為（29.31±0.87）×108cfu/mL,顯著高于單一菌株發(fā)酵（P＜0.05）.當(dāng)菌種比例為1:1 時感官評分亦最高,其值為（84.5±2.8）分,表明混合菌株發(fā)酵梨汁效果良好,因此選擇L.plantarum 和L.acidophillus 按體積比1:1 混合為最佳菌種.

2.1.2 發(fā)酵溫度對發(fā)酵梨汁的影響 不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵梨汁的活菌數(shù)和感官評分的影響結(jié)果見圖2.

圖2 發(fā)酵溫度對活菌數(shù)和感官評分的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on viable count and sensory evaluation

由圖2 可知,當(dāng)發(fā)酵溫度在33～37 ℃時,隨著溫度的升高,發(fā)酵梨汁的活菌數(shù)顯著增加（P＜0.05）.在37 ℃時活菌數(shù)達最高值,為（28.34±0.86）×108cfu/mL.隨著溫度繼續(xù)增加,活菌數(shù)減少.在37 ℃時發(fā)酵梨汁感官評分最高,其值為85.0±3.5 分,隨著溫度繼續(xù)升高,發(fā)酵梨汁感官評分降低,溫度過高會破壞梨汁中的芳香物質(zhì),從而影響梨汁的口感和風(fēng)味.因此37 ℃為最佳發(fā)酵溫度.

2.1.3 發(fā)酵時間對發(fā)酵梨汁的影響 不同發(fā)酵時間對發(fā)酵梨汁的活菌數(shù)和感官評分的影響結(jié)果見圖3.

圖3 發(fā)酵時間對活菌數(shù)和感官評分的影響Fig.3 Effect of fermentation time on viable count and sensory evaluation

由圖3 可知,當(dāng)發(fā)酵時間在18～24 h 時,梨汁的活菌數(shù)顯著增加,24 h 時活菌數(shù)達最大值為（28.53±0.06）×108cfu/mL；在24 h 和27 h 時,發(fā)酵梨汁的活菌數(shù)沒有顯著性差異（P＞0.05）；感官評分在 24 h 時達到最高值,為92.3±3.1 分,隨著發(fā)酵時間的增加感官評分逐漸降低,表明發(fā)酵時間過長可能會影響發(fā)酵梨汁中風(fēng)味物質(zhì),進而影響發(fā)酵梨汁的感官評分.因此最佳發(fā)酵時間為24 h.

2.1.4 接種量對發(fā)酵梨汁的影響 不同接種量對發(fā)酵梨汁的活菌數(shù)和感官評分的影響結(jié)果見圖4.

圖4 接種量對活菌數(shù)和感官評定的影響Fig.4 Effect of inoculum size on viable count and sensory evaluation

由圖4 可知,接種量體積分?jǐn)?shù)在1%～4%時,活菌數(shù)隨著接種量的增加而上升,當(dāng)接種量體積分?jǐn)?shù)為4%時,發(fā)酵梨汁的活菌數(shù)最高,為（28.55±0.17）×108cfu/mL；隨著接種量體積分?jǐn)?shù)增加至6%,活菌數(shù)與4%時沒有顯著性差異（P＞0.05）.同時在接種量體積分?jǐn)?shù)為1%～4%時,感官評分隨接種量體積分?jǐn)?shù)的增加而增加,4%時達到最大值為90.6±2.5 分.因此選擇體積分?jǐn)?shù)4%為最佳接種量.

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果和方差分析 基于單因素試驗結(jié)果,按照L.plantarum 和L.acidophillus 體積比為1:1,選取接種量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度3 個因素,以發(fā)酵梨汁活菌數(shù)和感官評分為指標(biāo),通過Box-Behnken 設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化試驗,試驗因素水平見表2.

表2 Box-Behnken 試驗設(shè)計因素水平Tab.2 Factors and level of response surface optimization in Box-Behnken design

表3 響應(yīng)面試驗結(jié)果Tab.3 Response surface test design and results

采用Design-Expert 8.0.5 軟件進行多元回歸擬合,得出活菌數(shù)（Y1）和感官評分（Y2）對接種量（A）、發(fā)酵時間（B）、發(fā)酵溫度（C）的二次多項回歸方程為分別為

式（1）、式（2）中：Y1為活菌數(shù),Y2為感官評分,A 為接種量,B 為發(fā)酵時間,C 為發(fā)酵溫度.

活菌數(shù)的方差分析及顯著性檢驗結(jié)果見表4.

表4 活菌數(shù)回歸模型方差分析及顯著性檢驗Tab.4 Analysis of variance and significance test of live bacterial count regression model

表5 感官評分回歸模型方差分析及顯著性檢驗Tab.5 Analysis of variance and significance test of sensory evaluation regression model

由表4 和表5 可知,兩個回歸方程模型極顯著（P<0.000 1）,失擬項檢驗結(jié)果不顯著.相關(guān)系數(shù)R2（活菌數(shù)）是0.989 2,R2（感官評分）是0.983 0,表明感官評分和活菌數(shù)的實測值和預(yù)測值之間擬合度較好,所以此模型擬合效果好,可用來分析預(yù)測乳酸菌發(fā)酵梨汁的工藝參數(shù).響應(yīng)值為活菌數(shù)和感官評分的模型回歸方程系數(shù)顯著性試驗均表明,一次項A 不顯著,B、C 是極顯著；交互項AB、BC 極顯著,AC 不顯著；二次項A2、B2、C2影響都極顯著.各因素對活菌數(shù)和感官評分的影響均為B（發(fā)酵時間）＞C（發(fā)酵溫度）＞A（接種量）.

2.2.2 響應(yīng)面分析 各因素交互作用對發(fā)酵梨汁活菌數(shù)的影響結(jié)果見圖5.

圖5 各因素交互作用對發(fā)酵梨汁活菌數(shù)的影響Fig.5 Effect of interaction of various factors on the viable count of fermented pear juice

由圖5-a 可知,當(dāng)接種量一定時,發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間的交互作用極顯著.在發(fā)酵溫度一定時,隨著發(fā)酵時間的增加,活菌數(shù)先增加后減少；在發(fā)酵時間一定時,活菌數(shù)隨著溫度的升高逐漸增加后減少.由圖5-b 可知,當(dāng)發(fā)酵溫度一定時,發(fā)酵時間和接種量的交互作用極顯著.在發(fā)酵時間一定時,活菌數(shù)隨著接種量的增加而顯著增加,后趨于平緩；在接種量一定時,活菌數(shù)隨著發(fā)酵時間的增加而顯著增加.

各因素交互作用對梨汁感官評分的影響結(jié)果見圖6.

圖6 各因素交互作用對梨汁感官評分的影響Fig.6 Effect of interaction of various factors on sensory evaluation of pear juice

由圖6-a 可知,當(dāng)接種量一定時,發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間的交互作用極顯著.在發(fā)酵溫度一定時,隨著發(fā)酵時間的增加,感官評分先增加后減少；在發(fā)酵時間一定時,感官評分隨著溫度的升高逐漸增加后減少.由圖6-b 可知,當(dāng)發(fā)酵溫度一定時,發(fā)酵時間和接種量的交互作用極顯著.在發(fā)酵時間一定時,隨著接種量的增加,感官評分先顯著增加后趨于平緩；在接種量一定時,感官評分隨著發(fā)酵時間的增加而顯著增加,后趨于平緩.

2.2.3 最佳條件的預(yù)測和驗證 通過回歸模型的預(yù)測得到發(fā)酵梨汁的最佳工藝為菌種接種量體積分?jǐn)?shù)3.71%、發(fā)酵時間25.20 h、發(fā)酵溫度37.63 ℃.此時發(fā)酵梨汁的感官評分的預(yù)測值90.14±0.92 分,活菌數(shù)為（29.83±0.68）×108cfu/mL.綜合考慮,把最優(yōu)條件修正為菌種接種量體積分?jǐn)?shù)4%、發(fā)酵時間25h、發(fā)酵溫度37 ℃.在此條件下進行3 次平行試驗進行驗證,得到發(fā)酵梨汁的活菌數(shù)為（29.53±0.68）×108cfu/mL,感官評分93.2±2.9 分.和預(yù)測值相比,活菌數(shù)和感官評分的誤差值分別是和1.10%和3.08%,說明采用響應(yīng)面進行優(yōu)化得出發(fā)酵梨汁的最佳工藝條件較可靠,驗證了該模型的有效性.

3 小結(jié)

利用乳酸菌發(fā)酵皇冠梨汁,菌種采用L.plantarum 和L acidophillus 按體積比為1:1 進行混合發(fā)酵.通過響應(yīng)面方法對發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化,最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間25 h、接種量體積分?jǐn)?shù)4%,在此條件下活菌數(shù)可達（29.53±0.68）×108cfu/mL,感官評分可達93.2±2.9 分.試驗獲得了具有較高活菌數(shù)和風(fēng)味良好的發(fā)酵梨汁,為實現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵梨汁的工藝優(yōu)化提供了理論和現(xiàn)實依據(jù).