2型糖尿病患者瘦素受體基因多態(tài)性與環(huán)境交互作用研究

王志迪 龐慧 崔萌 陳樂 趙靈燕，2

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學1公共衛(wèi)生學院預防醫(yī)學實驗中心，2慢性病分子流行病學重點實驗室（呼和浩特010110）

近幾十年來，全球糖尿病和糖耐量受損的發(fā)生率一直呈現(xiàn)逐年上升的趨勢［1］。研究表明，2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是受基因和環(huán)境共同作用影響的一種疾病［2］。瘦素受體（leptin receptor，LEPR）位于1p31 染色體上，通過激活信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活因子在瘦素信號轉(zhuǎn)導和葡萄糖代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮關鍵作用［3］，LEPR 基因已被認為是與T2DM 相關的候選基因之一［4］。一些可能對代謝調(diào)節(jié)有生物學影響的LEPR基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）已經(jīng)被國內(nèi)外學者進行了研究［5-6］。其中，有學者［7-8］發(fā)現(xiàn)瘦素受體rs1805096、rs1892534 和rs2211651 位點變異與T2DM發(fā)生具有相關性，但rs1805096單核苷酸多態(tài)性在法國人群中與增加胰島素抵抗風險無明顯相關性［9］。在過去幾年中，許多研究者利用廣義多因子降維法（generalized multifactor dimensionality reduction，GMDR）［10-11］來探索潛在的基因-基因或基因-環(huán)境交互作用，以發(fā)現(xiàn)復雜疾病可能的生物學途徑。因此，本研究基于GMDR 模型探討瘦素受體基因單核苷酸多態(tài)性與T2DM人群危險性的關系，通過納入與T2DM發(fā)生相關的環(huán)境危險因素，進行基因-環(huán)境交互作用分析，旨在人群流行病學資料基礎上探討呼和浩特地區(qū)漢族人群T2DM的病因線索，為制定相關干預措施及政策提供科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料2017年10月至2018年8月在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院、中醫(yī)醫(yī)院、國際蒙醫(yī)醫(yī)院收集T2DM 患者203 例（病例組），均符合1999年世界衛(wèi)生組織制定的糖尿病診斷標準，年齡30 ～70 歲，無心、肺、肝、腎、腦等并發(fā)癥或其他嚴重原發(fā)性疾病。選取同期在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院體檢中心健康體檢的對照人群203 例，年齡30 ～70 歲，且經(jīng)詢問病史均無肝腎、高血壓、內(nèi)分泌及其他心血管疾病。全部受試對象均為漢族且無親緣關系，并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 一般情況調(diào)查調(diào)查人員采用自行設計調(diào)查問卷進行面對面調(diào)查，調(diào)查內(nèi)容包括年齡、性別、個人史以及既往疾病史等。按照標準方法進行體格檢查，測量身高、體重、腰圍、臀圍等指標。

1.2.2 生化指標檢測所有研究對象均清晨空腹8 h 以上，分別采外周靜脈血5 mL 于EDTA 抗凝管和惰性分離膠促凝管內(nèi)，離心后收集血漿、血清和全血細胞，測量空腹血糖及血脂四項，血清瘦素水平檢測委托上海優(yōu)選生物科技有限公司采用酶聯(lián)免疫吸附試驗進行。

1.2.3 DNA 提取及瘦素受體基因SNP 測定調(diào)查者血液樣本采用試劑盒（天根生化科技有限公司）提取全血基因組DNA。應用紫外分光儀器檢測OD260/OD280比值，超純水為陰性對照，比值在1.8 左右，證明DNA 提取純度合格。上海天昊生物科技有限公司設計本次實驗PCR 擴增引物及多重單堿基延伸反應延伸引物（表1），并委托該公司采用多重高溫連接酶檢測反應技術(shù)進行LEPR 基因分型實驗。反應體系（20 μL）包含1x HotStarTaq buffer，

3.0 mM Mg2+，0.3 mM dNTP，1 U HotStarTaq polymerase（Qiagen Inc），1 μL 樣本DNA 和1 μL 多重PCR 引物。PCR 循環(huán)程序：95 ℃2 min；94 ℃20 s、65 ℃和-0.5 ℃/cycle 40 s、72 ℃1.5 min，共11 個循環(huán)；94 ℃20 s、59 ℃30 s、72 ℃1.5 min，24 個循環(huán)；72 ℃2 min、4 ℃forever；在10 μL PCR 產(chǎn)物中加入5U SAP 酶和2U Exonuclease I 酶，37 ℃溫浴1 h，然后75 ℃滅活15 min；10x連接緩沖液1 μL、高溫連接酶0.25 μL、5′連接引物混合液（1 μmol/L）0.4 μL，3′連接引物混合液（2 μmol/L）0.4 μL、純化后多重PCR 產(chǎn)物2 μL、ddH2O 6 μL 混勻，連接程序：94 ℃1 min、56 ℃4 min，38個循環(huán)；4 ℃forever；取0.5 μL稀釋后的連接產(chǎn)物，與0.5 μL Liz500 SIZE STANDARD，9 μL Hi-Di 混勻，95 ℃變性5 min 后上ABI3730XL測序儀。收集的原始數(shù)據(jù)用GeneMapper 4.1（AppliedBiosystems，USA）來分析并輸出結(jié)果。

表1 擴增的SNPs 的引物序列Tab.1 Primer sequence of amplified SNPs

1.3 統(tǒng)計學方法調(diào)查研究數(shù)據(jù)用Epidata 3.1 軟件錄入，通過SPSS 25.0（IBM，NewYork，USA）軟件進行分析。正態(tài)分布計量資料用均數(shù)±標準差表示，滿足參數(shù)檢驗條件資料時，組間比較采用t檢驗；不滿足參數(shù)檢驗條件資料時用中位數(shù)（四分位間距）表示，組間比較采用秩和檢驗；計數(shù)資料比較用χ2檢驗。雙側(cè)檢驗水準α = 0.05。采用二分類logistic 回歸分析法分析LEPR 基因型頻率及LEPR 基因位點在顯性模型和隱性模型下與T2DM的關聯(lián)性。應用SHEsis 在線平臺進行連鎖不平衡分析，Plink 1.07 軟件分析單體型、最小等位基因頻率（Minimum allele frequency，MAF）及Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗?；蛐团c環(huán)境危險因素交互作用應用GMDR 進行模型構(gòu)建和分析。

2 結(jié)果

2.1 基本情況病例組空腹血糖值高于正常值6.1 mmol/L，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），兩組在年齡、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、腰臀比（WHR）、血脂指標、高血壓疾病史、高脂飲食、吸煙狀況、飲酒上分布差異均無統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。病例組血清瘦素水平稍高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

2.2 瘦素受體SNP 位點基因型頻率分布LEPR基因rs1805096、rs1892534、rs2211651 位點均符合Hardy-Weinber 遺傳平衡定律。校正年齡等協(xié)變量后，基因型頻率分布在兩組間差異有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），見表3。

2.3 瘦素受體SNP 位點單體型分析LEPR 基因rs1805096、rs1892534、rs2211651 各位點間r2值均大于0.8，存在連鎖不平衡性，需進一步分析單體型，排除分布頻率小于0.03 的單體型，表4結(jié)果顯示LEPR 基因三個位點形成2 種單體型，校正年齡等協(xié)變量因素后，GCG 單體型在兩組間分布差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.4 瘦素受體基因多態(tài)性與2 型糖尿病關聯(lián)性分析二分類logistic 分析結(jié)果顯示，校正年齡等協(xié)變量，rs1805096 攜帶（GG + GA）基因型個體與攜帶AA 型個體相比、rs1892534 攜帶（CC + CT）基因型個體與攜帶TT 基因型個體相比、rs2211651 攜帶（TG + GG）基因型個體與攜帶TT 基因型個體相比，T2DM 發(fā)病風險增加（OR＞1），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表5。

2.5 基因-環(huán)境交互作用分析一階交互最優(yōu)模型是rs1805096 與高脂飲食的交互作用，交叉一致性為10/10，測試集精準度為0.7432，模型差異有統(tǒng)計學意義（P= 0.001 0）。校正協(xié)變量因素后，三因素交互顯示二階模型中rs1805096、rs1892534 及高血壓疾病史模型（P= 0.010 7）和rs1805096、rs2211651 及高脂飲食模型（P= 0.0010），差異均有統(tǒng)計學意義，見表6。

表2 病例組與對照組一般情況Tab.2 General situation of case group and control group±s

表2 病例組與對照組一般情況Tab.2 General situation of case group and control group±s

注：*為P ＜0.05

參數(shù)性別（男性）年齡（歲）BMI（kg/m2）WHR空腹血糖（mmol/L）甘油三酯（mmol/L）總膽固醇（mmol/L）高密度脂蛋白（mmol/L）低密度脂蛋白（mmol/L）血清瘦素（ng/L）糖尿病家族史［例（%）］是否高血壓疾病史［例（%）］是否吸煙［例（%）］是否飲酒［例（%）］是否高脂飲食［例（%）］是否體育鍛煉［例（%）］是否病例組118 57.05±10.29 25.92±5.30 0.92±0.83 8.67±3.76 2.13±1.53 4.95±1.31 1.29±0.37 2.84±0.96 12.25±3.08 35（17.24）168（82.76）80（39.41）123（60.59）76（37.40）127（62.60）79（38.90）124（61.10）150（73.90）53（26.10）117（57.60）86（42.40）對照組110 49.68±10.65 23.43±3.60 0.84±0.78 5.21±1.96 1.53±1.14 4.57±1.05 1.23±0.42 2.65±0.73 12.13±2.86 31（15.27）172（84.73）7（3.40）196（96.60）46（22.70）157（77.30）47（23.20）156（76.80）35（17.20）168（82.80）113（55.70）90（44.30）t/χ2值0.64-7.02-5.52-10.31-11.51-4.12-3.15-1.53-2.24-0.34 0.29 77.96 10.54 11.78 131.32 0.16 P值0.424＜0.001*＜0.001*＜0.001*＜0.001*＜0.001*0.002*0.128 0.028*0.736 0.592＜0.001*0.001*0.001*＜0.001*0.689

表3 瘦素受體SNP 位點基因型頻率分布Tab.3 Genotype frequency distribution of leptin receptor SNP loci

3 討論

基因與環(huán)境因素是T2DM 發(fā)病的重要因素［2］，雖然既往研究［12-13］表明了LEPR 基因與糖尿病密切相關，但該基因rs1805096、rs1892534、rs2211651與T2DM 發(fā)生的關系，特別在呼和浩特地區(qū)漢族人群中并未明確。因此，本研究納入406 例研究對象進行病例對照研究，發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古呼和浩特地區(qū)漢族人群LEPR 基因rs1805096、rs1892534、rs2211651 位點單核苷酸多態(tài)性與T2DM 易感性相關。

表6 瘦素受體各基因位點與環(huán)境交互作用GMDR 分析結(jié)果Tab.6 GMDR analysis result of interaction between leptin receptor gene loci and environment

在動物模型中，小鼠LEPR 基因純合常染色體突變可導致肥胖和胰島素抵抗，通過引入神經(jīng)元特異性LEPR-B 轉(zhuǎn)基因可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象，這證實了LEPR 基因在糖尿病發(fā)病中的關鍵作用［14］。有研究發(fā)現(xiàn)，血清瘦素水平升高可導致β 細胞受損甚至凋亡，從而引發(fā)胰島素抵抗［15］，本研究中病例組的瘦素水平高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義，可能與樣本量較小有關。

校正年齡等協(xié)變量后，LEPR 基因rs1805096、rs1892534、rs2211651 基因型頻率分布在兩組間差異有統(tǒng)計學意義。本研究結(jié)果顯示，rs1892534 位點（CC + CT）基因型與TT 基因型比較，T2DM 患病率增加2.905 倍，rs2211651 位點（TG + GG）基因型是TT 基因型患病率的2.604 倍，相關研究表明［16］，rs1892534 位點與C 反應蛋白的表達水平相關，現(xiàn)有證據(jù)證實，C 反應蛋白水平的變化可能是導致T2DM 發(fā)生的危險因素之一［17］。且LIAO 等［8］在中國臺灣人群中發(fā)現(xiàn)rs1892534 和rs2211651 位點變異與早發(fā)型T2DM 患者的遺傳易感性有關聯(lián)，與本研究結(jié)果一致。在本研究中，rs1805096 位點（GG+GA）基因型是AA 基因型患病率的2.905 倍，一項Meta 分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)［7］，中國人群rs1805096 位點在顯性遺傳模型下與T2DM 及肥胖具有相關性，但PHILLIPS 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，在法國人群中，rs1805096單核苷酸多態(tài)性與增加成人胰島素抵抗和代謝綜合征的風險無關聯(lián)，除此之外，DIAS 等［18］在巴西人群隊列研究的結(jié)果顯示，rs1805096 突變與代謝異常無關，這種差異可能是由于種族和背景的不同所導致。

研究表明，位于染色體上某一區(qū)域的一組相關聯(lián)的SNP 等位位點被稱作單體型，T2DM 是多基因復雜性疾病，單體型分析比單個SNP 分析更具有優(yōu)勢。本研究單體型分析表明，rs1805096-rs1892534-rs2211651 單 體 型GCG 與T2DM 風 險增加相關（OR= 2.588，95%CI：1.307 ～5.125），既往有研究發(fā)現(xiàn)LEPR 基因Arg109Lys、Asn656Lys、Pro1019Pro 位點AGC 單體型可能是中國華北地區(qū)T2DM 的危險因素，但目前關于rs1805096-rs1892534-rs2211651 構(gòu)成的單體型與T2DM 的關聯(lián)分析研究未見報道。

GMDR 是一種新穎而強大的檢測和建模上位性的統(tǒng)計工具，基本原理包括交叉驗證和計分統(tǒng)計量，利用降維的方法來檢測基因-基因、基因-環(huán)境之間相互作用，避免了Logistic 回歸模型等方法處理交互作用存在“維度災難”等局限性，從而導致研究結(jié)果假陽性率增加［19］?；?基因、基因-環(huán)境交互作用分析已經(jīng)廣泛應用于T2DM 的研究，ZHOU 等［20］發(fā)現(xiàn)GCKR 和G6PC2 基因交互作用可能增加中國漢族人群T2DM 發(fā)病風險；LI 等［21］發(fā)現(xiàn)TCF7L2 基因與BMI 和腰圍之間的交互作用可能在T2DM 發(fā)生風險中起重要作用。GMDR 分析交互作用時，當交互階數(shù)越高，需要樣本量越多才能獲得更穩(wěn)定的結(jié)果，本研究受樣本量限制，將LEPR 基因的三個基因位點分別與環(huán)境因素（糖尿病家族史、高血壓疾病史、吸煙、飲酒、高脂飲食、體育鍛煉）引入模型，校正年齡等協(xié)變量，分析基因-環(huán)境交互作用，結(jié)果顯示一階交互最優(yōu)模型是rs1805096 與高脂飲食的交互作用，交叉一致性為10/10；二階模型rs1805096、rs1892534 及高血壓疾病史模型和rs1805096、rs2211651 及高脂飲食模型均存在交互作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古呼和浩特地區(qū)漢族人群LEPR 基因rs1805096、rs1892534、rs2211651 位點單核苷酸多態(tài)性與T2DM 易感性相關，GCG 單體型與T2DM 風險增加相關，且LEPR基因rs1805096、rs1892534 及高血壓疾病史模型和rs1805096、rs2211651 及高脂飲食模型之間的交互作用可能與T2DM 的發(fā)生有關聯(lián)。本研究存在一定的局限性，僅探討了呼和浩特地區(qū)漢族人群，且樣本量有限，今后我們將繼續(xù)加大樣本量，進行多地區(qū)不同民族、不同環(huán)境因素的研究，進一步驗證LEPR 基因rs1805096、rs1892534、rs2211651 與2 型糖尿病之間的關系。