新型黏著斑激酶抑制劑CT-707對(duì)肝癌細(xì)胞的影響及機(jī)制研究

姚紅兵 郭威 吳嘉興 蔣建暉 李桂鮮

桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院肝膽胰外科（廣西桂林541000）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一種惡性程度極高的腫瘤，由于治療手段的局限，且預(yù)后較差，容易復(fù)發(fā)，因此病死率極高［1-5］。與其他實(shí)體瘤相比，HCC 的主要特點(diǎn)包括高侵襲性和高轉(zhuǎn)移能力［6-8］。盡管臨床上已經(jīng)針對(duì)HCC 展開了大量的研究，但是HCC 目前預(yù)后仍然較差，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高，5年生存率仍然很低［9-10］。造成這種現(xiàn)象的主要原因是HCC 發(fā)病早期癥狀不明顯，當(dāng)患者被診斷出HCC 時(shí)已經(jīng)處于無(wú)法治愈的晚期［11-13］。索拉菲尼是國(guó)內(nèi)目前唯一經(jīng)過(guò)批準(zhǔn)的用于治療肝癌的靶向治療藥物，在治療后期腫瘤細(xì)胞容易出現(xiàn)藥物耐受，臨床治療效果不佳［14-16］。因此，尋找一種副作用少、安全性高的新型抗癌藥物用于肝癌治療迫在眉睫。

CT-707 是一種新型多靶點(diǎn)激酶抑制劑，能夠通過(guò)拮抗FAK 影響腫瘤微環(huán)境和腫瘤進(jìn)展［17-20］。本研究主要通過(guò)生化分子、細(xì)胞生物學(xué)以及小鼠成瘤模型等手段探討CT-707 對(duì)肝癌細(xì)胞系JHH7的影響及可能參與的信號(hào)通路，為臨床上治療肝癌提供新的方向和策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于上海林暢生物有限公司購(gòu)買12 只雌性SPF 級(jí)BALB/c 裸鼠，周齡為6 周，飼養(yǎng)在SPF 等級(jí)鼠房，室溫恒定，通風(fēng)良好，水和食物充足。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過(guò)桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 HCC 細(xì)胞株HCC 細(xì)胞株JHH7 培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素/鏈霉素的DMEM中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱。細(xì)胞傳代時(shí)，去掉培液，PBS 清洗后用胰蛋白酶37 ℃消化2 min。細(xì)胞分實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組使用1.6 nmol/L 的CT-707（DMSO 溶液）處理細(xì)胞，對(duì)照組使用同體積DMSO 處理細(xì)胞。

1.3 試劑CT-707（Selleck，中國(guó)）；血清（Hyclone，中國(guó)）；DMEM（Hyclone，中國(guó)）；RNA 提取試劑盒（Thermo，USA）；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（promega，USA）；AKT、pAKT、mTOR、pmTOR、β-actin 抗體（sigma，USA）

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 MTT 試驗(yàn)細(xì)胞藥物處理48 h 后，用MTT法檢測(cè)JHH7 細(xì)胞的存活情況。將不同組細(xì)胞鋪在96 孔板（5 × 103細(xì)胞/孔），37 ℃培養(yǎng)24 h。MTT 溶液（0.5 mg/mL）被添加到每個(gè)孔中，37 ℃培養(yǎng)3 h。隨后，加入DMSO 溶解甲瓚晶體。采用ELISA plate reader（Bio-Rad Laboratories，Inc.）檢測(cè)490 nm 波長(zhǎng)的吸光度，檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

1.4.2 克隆形成試驗(yàn)用克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況將不同組細(xì)胞鋪在6 孔板（5 × 104細(xì)胞/孔），37 ℃培養(yǎng)72 h。去掉培液后，每孔加2 mL 4% PFA 稀釋的結(jié)晶紫（終濃度為0.02%），室溫孵育1 h 后，去掉染液，用PBS 洗兩次，拍照。

1.4.3 Annexin V 試驗(yàn)為了檢測(cè)細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞處理48 h 后，使用Annexin-V-FLUOS Staining kit（Roche Diagnostics，Basel，Switzerland）進(jìn)行Annexin-V-FLUOS 檢測(cè)。具體步驟是，在室溫下1 000 r/min離心5 min 后，細(xì)胞用500 μL 結(jié)合緩沖液重懸。接下來(lái)，加入5 μL Annexin V 和10 μL propidium iodide 溶液，在暗室中室溫放置15 min。然后使用FACSCalibur 流式細(xì)胞儀（BD Biosciences，F(xiàn)ranklin Lakes，USA）進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，并使用CXP 軟件1.0（Beckman Coulter，Inc.，Brea，CA，USA）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.4.4 Western blot 檢測(cè)對(duì)于蛋白質(zhì)的提取，細(xì)胞被置于radioimmunoprecipitation assay lysis buffer（Beyotime Institute of Biotechnology，Haimen，China）中，14 000 r/min 4 ℃離心15 min。然后用Nano-Drop 2000 儀器（Thermo Fisher Scientific，Inc.）測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。等量的蛋白質(zhì)被12%的SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。隨后用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，膜用PBST 洗3 次后，抗體4 ℃孵育過(guò)夜。隨后用PBS T 洗滌3 次，然后用HPRT 標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h（1∶10 000；cat. no. sc-516180；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）。孵育后，用PBS-T洗滌3 次，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（Beyotime Institute of Biotechnology）分析抗原-抗體復(fù)合物。使用β-actin 作為內(nèi)參。Western blot 結(jié)果由Image J 軟件1.48 版本（National Institutes of Health，Bethesda，MD，USA）進(jìn)行量化。

1.4.5 裸鼠皮下移植瘤模型從斯萊克公司購(gòu)買6 周大小的雌性Balb/c 裸鼠，在SPF 等級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)，分為對(duì)照組和CT-707 組。在肝癌細(xì)胞系裸鼠移植成瘤模型中，將肝癌細(xì)胞系JHH7 重懸至20 million/mL，每次皮下注射100 μL，每只裸鼠注射兩側(cè)（做皮下裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)一般都是大腿腹股溝兩側(cè)均注射），注射部位為大腿腹股溝，每組注射6 只。等到腫瘤長(zhǎng)到5 ～6 mm 的時(shí)候，腹腔注射CT-707（20 mg/kg），間隔1 d 注射1次，每周測(cè)定動(dòng)物體質(zhì)量、瘤體大小2 次，連續(xù)給藥45 d，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)測(cè)定瘤質(zhì)量和主要臟器質(zhì)量，對(duì)瘤體和動(dòng)物主要臟器進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，并計(jì)算抑瘤率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有的數(shù)據(jù)使用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0 軟件（IBM，Armonk，NY，USA）和GraphPad Prism 5.0 軟件（GraphPad software，Inc.，La Jolla，CA，USA）進(jìn)行。采用單因素方差分析的方法分析各組間的差異，然后進(jìn)行Dunnett′st檢驗(yàn)。P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CT-707 能夠降低細(xì)胞的存活能力，抑制細(xì)胞的增殖MTT 試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，CT-707 處理能夠明顯降低細(xì)胞的存活能力，且這個(gè)過(guò)程具有時(shí)間依賴性，CT-707 處理時(shí)間越久，對(duì)細(xì)胞的存活影響越強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，（圖1）；克隆形成試驗(yàn)表明，與對(duì)照組相比，CT-707 處理能夠顯著抑制細(xì)胞的增殖，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

圖1 CT-707 對(duì)細(xì)胞存活能力的影響Fig.1 The effect of CT-707 on cell viability

2.2 CT-707 能夠抑制細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡流式結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，CT-707 處理能夠明顯抑制DNA 的復(fù)制，促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯，使細(xì)胞周期停留在G1 期，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，CT-707 處理能夠明顯促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）；Western blot 結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，CT-707 處理能夠明顯抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白PCNA、Cyclin D1 的表達(dá)，促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白CI-caspase-7、CI-caspase-9 的表達(dá)（表2）。以上結(jié)果表明CT-707 能夠抑制細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

圖2 CT-707 對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響Fig.2 The effect of CT-707 on cell proliferation

表1 CT-707 對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響Tab.1 The effects of CT-707 oncell cycle and apoptosis±s

表1 CT-707 對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響Tab.1 The effects of CT-707 oncell cycle and apoptosis±s

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05

組別對(duì)照組CT-707 組細(xì)胞周期G1 期52.26±0.45 62.85±2.42*S 期22.38±1.52 18.62±1.15*G2/M 期16.41±0.85 15.89±0.71細(xì)胞凋亡（%）9.21±1.68 13.31±1.22*

表2 CT-707 對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響Tab.2 The effects of CT-707 oncell cycle related proteins and cell apoptosis related proteins±s

表2 CT-707 對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響Tab.2 The effects of CT-707 oncell cycle related proteins and cell apoptosis related proteins±s

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05

組別對(duì)照組CT-707 組細(xì)胞周期相關(guān)蛋白PCNA 1.00±0.02 0.62±0.05*Cyclin D1 1.00±0.03 0.80±0.04*細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白CI-caspase-7 1.00±0.01 3.24±0.12*caspase-7 1.00±0.02 1.86±0.62*CI-caspase-9 1.00±0.02 12.35±1.12*caspase-9 1.00±0.01 1.63±0.56*

2.3 CT-707 能夠抑制腫瘤的形成裸鼠皮下移植模型表明，CT-707 腹腔注射能夠顯著抑制腫瘤的形成，腫瘤的大小和質(zhì)量顯著降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。以上結(jié)果表明CT-707 能夠抑制腫瘤的形成。

3 討論

HCC 是我國(guó)發(fā)病率和死亡率極高的惡性腫瘤，由于肝癌早期癥狀不明顯，因此超過(guò)一半的患者在確診時(shí)為晚期［21］。由于目前臨床上針對(duì)肝癌的治療手段有限，唯一批準(zhǔn)上市的肝癌靶向藥物索拉菲尼副作用較大，且腫瘤細(xì)胞容易出現(xiàn)藥物耐受而復(fù)發(fā)。因此對(duì)于深入研究肝癌發(fā)病機(jī)制、開發(fā)新型安全有效的分子靶向藥物，對(duì)于肝癌的治療尤為重要。

CT-707 是一種多靶點(diǎn)激酶抑制劑，能夠通過(guò)拮抗多種酪氨酸激酶如FAK、ALK 等，影響腫瘤微環(huán)境和腫瘤的發(fā)生，目前該藥物正在進(jìn)入臨床Ⅰ期試驗(yàn)［22-25］。MTT 試驗(yàn)和克隆形成試驗(yàn)常用來(lái)進(jìn)行大規(guī)模抗癌藥物篩選，是體外檢測(cè)細(xì)胞存活和增殖能力常用的手段［26-27］。本研究發(fā)現(xiàn)，CT-707處理能夠降低細(xì)胞的存活能力，過(guò)程具有時(shí)間依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；克隆形成試驗(yàn)表明，與對(duì)照組相比，CT-707 處理能夠抑制細(xì)胞的增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。以上結(jié)果表明CT-707 能夠降低細(xì)胞的存活能力，抑制細(xì)胞的增殖。裸鼠皮下成瘤模型則是模擬藥物在體內(nèi)對(duì)腫瘤的影響［30］。本研究發(fā)現(xiàn)CT-707 腹腔注射能夠顯著抑制腫瘤的形成，腫瘤的大小和質(zhì)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 CT-707 對(duì)腫瘤形成的影響Fig.3 The effect of CT-707 on tumor formation

流式檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡是用于檢測(cè)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞影響常用的生物學(xué)手段［28-29］。本研究發(fā)現(xiàn)，CT-707 處理能夠明顯抑制DNA 的復(fù)制，促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯；CT-707 處理還能夠明顯促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；以上結(jié)果表明CT-707 能夠抑制細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，從而抑制腫瘤的形成。

在大部分的腫瘤細(xì)胞中，PI3K/AKT 通路會(huì)處于異?；罨癄顟B(tài)，AKT 和mTOR 會(huì)處于高度磷酸化狀態(tài)，并且此通路與細(xì)胞的增殖和凋亡有關(guān)，抑制該通路的活化會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化，因此PI3K/AKT 通路是臨床治療腫瘤的重要靶點(diǎn)［31-32］。為了探討CT-707 影響細(xì)胞存活和腫瘤形成的具體分子機(jī)理，本課題下一步研究擬通過(guò)Western-blot 檢測(cè)了PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，探討CT-707 是否能夠抑制PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路的激活來(lái)抑制肝癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤的形成。

本研究首次證實(shí)了新型多靶點(diǎn)激酶抑制劑CT-707 對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并分析了其相關(guān)機(jī)制，為臨床上肝癌治療靶點(diǎn)的選擇提供理論依據(jù)。但本研究仍舊存在一定不足和局限性。本研究只使用肝癌細(xì)胞系和裸鼠皮下成瘤模型，未來(lái)可能需要使用PDX 模型做進(jìn)一步的功能研究，以及藥物對(duì)機(jī)體的副作用，從而為臨床用藥提供理論基礎(chǔ)。目前細(xì)胞學(xué)研究主要集中在CT-707 對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡以及細(xì)胞周期的影響，但對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為有待進(jìn)一步分析。本研究中CT-707 對(duì)肝癌細(xì)胞作用的信號(hào)通道方面機(jī)制，也有待進(jìn)一步深入探討，包括分析PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路下游相關(guān)因子的影響以及其他相關(guān)通路的作用機(jī)制，以及在進(jìn)一步的體內(nèi)試驗(yàn)研究中還需探討對(duì)肝癌動(dòng)物模型生存期以及腫瘤進(jìn)展、復(fù)發(fā)等的影響，以便為臨床試驗(yàn)提供更多依據(jù)。