國(guó)產(chǎn)DNA測(cè)序儀及提取試劑在接觸DNA檢驗(yàn)中的應(yīng)用

李濤 張丹丹 焦靈霞 河南省周口市商水縣公安局

引言

隨著科技的發(fā)展、網(wǎng)絡(luò)的普及、法制化的推進(jìn)，高智商犯罪越來(lái)越多，嫌疑人能夠獲取更多的反偵察技術(shù)，嫌疑人在現(xiàn)場(chǎng)遺留的指紋、有價(jià)值的足印、血跡在現(xiàn)場(chǎng)已經(jīng)很難提取到，加上嫌疑人的刻意偽裝回避、不攜帶通訊工具等手段，現(xiàn)場(chǎng)視頻、技術(shù)偵查手段也無(wú)從使用，此時(shí)犯罪現(xiàn)場(chǎng)接觸DNA的提取和檢驗(yàn)就顯得尤為重要。接觸DNA檢材屬于微量疑難生物檢材，其檢驗(yàn)是法醫(yī)DNA檢驗(yàn)的難點(diǎn)和熱點(diǎn)[1]，隨著微量檢材數(shù)量日益增多，如何提高接觸DNA的檢驗(yàn)成功率，成為每個(gè)DNA實(shí)驗(yàn)室都要面臨的關(guān)鍵問(wèn)題。

一、接觸DNA檢驗(yàn)方案

以往文獻(xiàn)對(duì)于接觸DNA檢驗(yàn)成功率的報(bào)道結(jié)果差異較大，從9%到45%不等[2]。由于接觸DNA檢測(cè)步驟復(fù)雜，檢驗(yàn)成功率易受各環(huán)節(jié)多因素影響，導(dǎo)致檢驗(yàn)成功率差異很大，接觸DNA檢材從檢測(cè)流程上來(lái)講與其它常見(jiàn)生物檢材并無(wú)差異，同樣可分為提取、擴(kuò)增、電泳及結(jié)果分析等步驟，但接觸DNA檢驗(yàn)在上述環(huán)節(jié)的具體操作上有其特殊性，包括關(guān)鍵接觸部位的確定與發(fā)現(xiàn)、接觸DNA的提取與純化、擴(kuò)增參數(shù)的選擇、電泳參數(shù)的設(shè)定、結(jié)果的分析與運(yùn)用等，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)水平提出了較高要求。

對(duì)于接觸DNA檢驗(yàn)，在前處理環(huán)節(jié)上，應(yīng)結(jié)合具體案情分析和載體的物理特性，有針對(duì)性的選擇兩步擦拭、直接剪取、膠帶粘取、真空吸附、震蕩沖洗等合適的方法進(jìn)行前處理；在提取環(huán)節(jié)上，可選用常見(jiàn)的磁珠法、硅珠法、Chelex-100等，目前有很多商業(yè)化的試劑盒及提取工作站可供選擇，常見(jiàn)的提取試劑盒如DNA IQTM試劑盒、QIAampTMDNA Investigator試劑盒、D盾超敏提取試劑盒、超高效硅珠純化DNA提取試劑盒等，同時(shí)許多核酸自動(dòng)提取儀如KingFisherTM、 QIACubeTM、 MagNA PureTM等都提供配套的純化試劑盒可供選擇[2]，為得到更高純度的接觸DNA，還可以通過(guò)調(diào)整洗脫液體積或采用離心超濾管與配套試劑盒進(jìn)行濃縮[3]；PCR擴(kuò)增環(huán)節(jié)可以采用增加循環(huán)數(shù)、縮小反應(yīng)體系、優(yōu)化引物、延長(zhǎng)退火時(shí)間、改變緩沖體系等不同的方法來(lái)提高檢驗(yàn)靈敏度；電泳檢測(cè)可通過(guò)增加上樣量（提高上樣電壓或增加進(jìn)樣時(shí)間）、增大激光器功率、使用高質(zhì)量甲酰胺等方法改善電泳質(zhì)量；數(shù)據(jù)分析環(huán)節(jié)可采取降低分析閾值、進(jìn)行重復(fù)檢驗(yàn)認(rèn)定多次出現(xiàn)的等位基因等方法謹(jǐn)慎研判和應(yīng)用DNA分型結(jié)果。

商水縣公安局DNA實(shí)驗(yàn)室自2017年底投入使用以來(lái)，采用D盾超敏DNA提取試劑盒[4]、 PowerPlexTM21和VeriFilerTMPlus擴(kuò)增試劑盒、國(guó)產(chǎn)GA118-16A型遺傳分析儀進(jìn)行接觸DNA檢驗(yàn)，取得了較好的檢驗(yàn)效果，在打擊犯罪、維護(hù)社會(huì)穩(wěn)定方面效果明顯。

二、典型應(yīng)用案例

（一）案例資料

2019年9月27日，商水縣某村村民蘇某家的狗在門(mén)口被人盜走，因涉案價(jià)值不夠立刑事案件，派出所民警未通知技術(shù)人員出現(xiàn)場(chǎng)，從蘇某家大門(mén)口地面上提取毒鏢（1號(hào)檢材）一枚。

2020年4月26日，村民郭某某家院內(nèi)養(yǎng)的杜賓犬被盜，價(jià)值10000多元，技術(shù)人員現(xiàn)場(chǎng)提取嫌疑人翻墻木梯子上粘取物（2號(hào)檢材）1份、綁有雞頭的藥狗蛋（3號(hào)檢材，圖1）1個(gè)、毒鏢（4號(hào)檢材，圖1）1枚。

（二）接觸DNA檢驗(yàn)

1.檢材前處理及DNA提取

（1）毒鏢（1號(hào)檢材）：對(duì)毒鏢針管管身用脫落細(xì)胞粘取器分段粘取后，用棉簽分干濕兩步擦拭提取，之后將粘取器上粘性膠片、棉簽擦拭物放入1.5ml離心套管中，加入200 μL裂解液，漩渦振蕩10s后56℃孵育30min，再99℃裂解10min。裂解結(jié)束后17000g離心3min，棄除離心套管，加入1000 μL吸附液和20 μL吸附珠，室溫靜置15min后8000g離心30s去除上清液，再向沉淀物中加入-20℃漂洗液800 μL，將沉淀物充分震開(kāi)后8000g離心30s，去凈上清液，烘干，加入35 μL洗脫液，56℃孵育20min；

（2）木梯粘取物（2號(hào)檢材）：將脫落細(xì)胞粘取器上粘性膠片剝離后導(dǎo)入離心套管，按D盾超敏DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提??；

（3）綁有雞頭的藥狗蛋（3號(hào)檢材）：分離藥狗蛋和雞頭，將綁線(xiàn)剪成小段后直接放入離心套管，再對(duì)膠囊部分用棉簽分干濕兩步擦拭提取，提取盡量避開(kāi)油污，按D盾超敏DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提??；

（4）毒鏢（4號(hào)檢材）：對(duì)毒鏢針管管身分段粘取后用棉簽分干濕兩步擦拭提取，之后粘取器上粘性膠片、棉簽擦拭物分開(kāi)放入1.5ml離心套管中；針管與尾翼結(jié)合處的纏繞膠帶，先用棉簽擦拭后用鑷子剝離管身，分段剪開(kāi)，將碎片和棉簽分開(kāi)放入1.5ml離心套管，其余處理步驟同1號(hào)檢材。

2.PCR擴(kuò)增

1號(hào)檢材用PowerPlexTM21試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增總體積10 μL，DNA模板6 μL；2、3、4號(hào)檢材用VeriFilerTMPlus試劑盒擴(kuò)增（與1號(hào)檢材檢驗(yàn)時(shí)間不同），擴(kuò)增總體積10μ L，DNA模板7 μL，其余操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。

3.電泳檢測(cè)

上述擴(kuò)增產(chǎn)物在GA118-16A型測(cè)序儀上按標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行電泳檢測(cè)，應(yīng)用GeneMapperTMID-X 1.4分析軟件進(jìn)行分析（分析閾值50RFU）。

4.結(jié)果

經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)，1號(hào)檢材上檢出1名男性DNA分型，如圖2所示，經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)比中前科人員申某某，嫌疑人抓獲歸案后經(jīng)采血檢驗(yàn)，證實(shí)申某某為該盜竊案件嫌疑人；2、3、4號(hào)檢材上分別檢出同一男性DNA分型，如圖3所示，經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)，比中前科人員顧某某，到案后經(jīng)采血檢驗(yàn)，證實(shí)顧某某確為該盜竊案件嫌疑人。

三、討論

接觸DNA檢驗(yàn)作為一門(mén)新興技術(shù)，應(yīng)用前景廣闊，在未來(lái)的案件偵破中會(huì)發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。許多接觸性檢材無(wú)法檢出有效分型，其原因可能有多方面，商水縣公安局DNA實(shí)驗(yàn)室在三年多的檢驗(yàn)工作中主要遇到以下三方面問(wèn)題：檢出多人混合造成的分型無(wú)法判讀、抑制物較多造成的無(wú)法檢出、DNA含量過(guò)低造成的無(wú)法檢出。

針對(duì)上述三個(gè)問(wèn)題，筆者總結(jié)出如下應(yīng)對(duì)辦法：

1.為了避免檢出多人混合分型、應(yīng)盡量縮小提取面積，分塊多次提取。如上述4號(hào)檢材毒鏢曾經(jīng)被制作人、案件受害人等多人觸碰，針管管身多處檢出混合分型，通過(guò)分塊多次提取，在纏繞針管的膠帶碎片中檢出單一男性分型。

2.對(duì)可能造成擴(kuò)增抑制的檢材處理時(shí)，應(yīng)盡量選擇檢材較為潔凈處提取，避免提取到對(duì)擴(kuò)增有抑制作用的含有酸、堿、油漆、動(dòng)植物油等成分，如無(wú)法避免，應(yīng)盡量少粘；提取后可對(duì)DNA先進(jìn)行純化，或者擴(kuò)增時(shí)做稀釋處理。如上述綁有雞頭的藥狗蛋，在帶油脂的藥狗蛋表面擦拭物上，未檢出有效分型，在綁雞頭的線(xiàn)繩較潔凈處進(jìn)行提取，檢出1名男性的完整分型。

3.針對(duì)DNA含量過(guò)低造成的無(wú)法檢出問(wèn)題，有以下幾個(gè)方面可以進(jìn)行優(yōu)化：

（1）為了提高檢出率，在現(xiàn)場(chǎng)勘查時(shí)應(yīng)充分了解案情，根據(jù)痕跡物證指向，重點(diǎn)提取，提取檢材時(shí)應(yīng)盡量多提幾處，針對(duì)不同檢材的潔凈程度，選擇不同力度提??；

（2）在進(jìn)行DNA提取時(shí)，選用DNA提取率較高的方法，最大限度獲得DNA模板含量；

（3）在選用提取試劑時(shí)，盡量選用靈敏度較高的試劑。本文案例中所用D盾超敏DNA提取試劑盒，雖是國(guó)產(chǎn)試劑，通過(guò)商水縣公安局DNA實(shí)驗(yàn)室三年多來(lái)的應(yīng)用，其效果與進(jìn)口提取試劑處于同一水平，本文案例中檢材提取模板量為35μ L，是一般微量DNA檢材提取模板量的近2倍，足以進(jìn)行3次平行擴(kuò)增或者3次梯度擴(kuò)增用和2次YSTR擴(kuò)增，保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

（4）在進(jìn)行電泳分型檢測(cè)時(shí)，選用靈敏度高的儀器。本文案例中的檢材均為接觸DNA檢材，使用國(guó)產(chǎn)提取試劑進(jìn)行提取和常規(guī)擴(kuò)增之后，采用國(guó)產(chǎn)GA118-16A遺傳分析儀進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，對(duì)于木梯、毒鏢、藥狗蛋上的脫落細(xì)胞等微量檢材都獲得了良好的分型，提取效果和檢驗(yàn)質(zhì)量均經(jīng)得起復(fù)核[5]。

上述方法經(jīng)過(guò)商水縣公安局DNA實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用取得了良好的使用效果，三年多以來(lái)協(xié)助偵查人員打掉系列入室盜竊、盜竊車(chē)內(nèi)財(cái)物、接觸性詐騙、搶劫等案件犯罪團(tuán)伙40余個(gè)。