甘肅耐氨基糖苷類結(jié)核分枝桿菌樣本相關(guān)基因位點(diǎn)的研究

高愷，同重湘，楊增偉 ，吳玲，車團(tuán)結(jié)

1、甘肅省功能基因組與分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州，730000

2、甘肅省傳染病院，甘肅蘭州，730000

3’甘肅省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，甘肅蘭州，730000

根據(jù)2012 年世界衛(wèi)生組織調(diào)查顯示：2011 年全球確診MDR-TB 患者310 000 例，其中印度、中國和俄羅斯占60%[2]。MDR-TB、XDR-TB 患者往往預(yù)后較差， MDR-TB 若治療不當(dāng)，就可能進(jìn)一步發(fā)展成XDR-TB， 后者將面臨或已處于無藥可治的窘境，在二線抗結(jié)核藥物中，二線氨基糖類藥物對MDR-TB 敏感性較高， 常優(yōu)先用于治療MDR-TB[3]。因此對二線氨基糖類藥物耐藥機(jī)制的研究，可進(jìn)一步了解XDR-TB 發(fā)生機(jī)制，提高M(jìn)DR-TB 治愈率，減少XDR-TB 發(fā)生。

氨基糖苷類抗生素（Aminoglycosides）是由氨基糖與氨基環(huán)醇通過氧橋連接而成的苷類抗生素，一線氨基糖苷類藥物是指用于治療結(jié)核病的鏈霉素，二線主要指卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素，目前主要用于治療廣泛耐藥結(jié)核病XDR-TB。

耐多藥結(jié)核病是結(jié)合病治療中的重點(diǎn)和難點(diǎn)，開展結(jié)核分枝桿菌耐藥性的動態(tài)監(jiān)測，是病控制工作的重要內(nèi)容。

材料與方法

一、樣本來源

89個結(jié)核分枝桿菌臨床分離株樣本由蘭州肺科醫(yī)院提供，所有樣本均進(jìn)行了氨基糖苷類藥物藥敏試驗(yàn)；

二、方法

1.痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和菌種鑒定及藥敏試驗(yàn)。

2.耐多藥結(jié)核分枝桿菌對氨基糖苷類藥物耐藥相關(guān)基因rrs與rpsl突變的基因測序及NCBI中的序列比對分析。

三、測序數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)用DNAMAN軟件分析測序結(jié)果，比對是否突變。將NCBI中結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株的rrs與rpsl基因與測序樣本的rrs與rpsl基因比對，同一株的突變數(shù)據(jù)與耐藥數(shù)據(jù)相對應(yīng)分析突變與耐藥的關(guān)系。

結(jié)果

一、藥敏試驗(yàn)與測序比對

86個結(jié)核分枝桿菌分離株樣本中，86個樣本中50個對鏈霉素耐藥，耐藥率為58.14%。86個樣本中5個對卡那霉素耐藥。耐藥率為5.81%。86個樣本中3個對阿米卡星耐藥。耐藥率為3.4%。86個樣本中15個對卷曲霉素耐藥。耐藥率為17.44%。

表1 耐卷曲霉素樣本rrs、rpsl基因突變位點(diǎn)

86個樣本中50個對鏈霉素耐藥，耐藥率為58.14%。86樣本中24個樣本在rpsl發(fā)生了點(diǎn)突變，臨床樣本藥敏結(jié)果顯示24個點(diǎn)突變樣本：其中9個樣本突變類型為A263G，9個樣本均對鏈霉素耐藥，其突變耐藥率為100%。其中15個樣本的突變類型為A128G，15個樣本均對鏈霉素耐藥，其突變耐藥率為100%。86樣本中10個樣本在rrs發(fā)生了點(diǎn)突變，臨床樣本藥敏結(jié)果顯示10個點(diǎn)突變樣本：其中1株突變類型為G5T，其突變類型對鏈霉素不耐藥。其中2株突變類型為A513C，均對鏈霉素耐藥。其中1株突變類型為C517T，對鏈霉素耐藥。其中2株突變類型為T1030C，其突變類型對鏈霉素不耐藥。其中1株突變類型為A1401G，其突變類型對鏈霉素耐藥。其中2株突變類型為C1456T，均對鏈霉素耐藥。其中1株突變類型為G1481T，其突變類型對鏈霉素耐藥。

表2 耐卡那霉素樣本rrs、rpsl基因突變位點(diǎn)

86個樣本中5個對卡那霉素耐藥。耐藥率為5.81%。86樣本中24個樣本在rpsl發(fā)生了點(diǎn)突變，臨床樣本藥敏結(jié)果顯示24個點(diǎn)突變樣本：突變類型rpslA128G共有9個樣本，其中5521樣本耐藥。突變類型rpslA263G共有15個樣本，其中5428、5769樣本耐藥。86樣本中10個樣本在rrs發(fā)生了點(diǎn)突變，臨床樣本藥敏結(jié)果顯示10個點(diǎn)突變樣本：突變類型rrsA1401G、rrsG1484T耐藥，耐藥樣本編號為5428、5461。

86個樣本中3個對阿米卡星耐藥。耐藥率為3.4%。86樣本中24個樣本在rpsl發(fā)生了點(diǎn)突變，臨床樣本藥敏結(jié)果顯示24個點(diǎn)突變樣本：突變類型rpslA128G共有9個樣本，其中編號5521樣本耐藥。突變類型rpslA263G共有15個樣本，其中編號5428樣本耐藥。86樣本中10個樣本在rrs發(fā)生了點(diǎn)突變，臨床樣本藥敏結(jié)果顯示10個點(diǎn)突變樣本：突變類型rrsA1401G、rrsG1484T耐藥。耐藥樣本編號為5428、5461。

86個樣本中15個對卷曲霉素耐藥。耐藥率為17.44%。86樣本中24個樣本在rpsl發(fā)生了點(diǎn)突變，臨床樣本藥敏結(jié)果顯示24個點(diǎn)突變樣本：突變類型rpslA128G共有9個樣本，其中編號5521樣本耐藥。突變類型rpslA263G共有15個樣本，其中編號5428樣本耐藥。86樣本中10個樣本在rrs發(fā)生了點(diǎn)突變，臨床樣本藥敏結(jié)果顯示10個點(diǎn)突變樣本：突變類型rrsA1401G、rrsG1484T耐藥，耐藥樣本編號為5428、5461。

討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)造成結(jié)核分枝桿菌耐藥機(jī)制與基因突變相關(guān)。不同的基因突變使感染人體的結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生不同藥物耐受性。實(shí)時熒光PCR技術(shù)將擴(kuò)增和檢測兩部和一，具有實(shí)時擴(kuò)增實(shí)時檢測、高效、快捷、簡單、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，可以同時對結(jié)核分枝耐藥多個基因同時進(jìn)行檢測，特別適用于大批量檢測。

因此應(yīng)用熒光定量PCR高分辨率熔解曲線法，根據(jù)點(diǎn)突變序列熔點(diǎn)變化，實(shí)時PCR檢測結(jié)核分枝桿菌基因組中的耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)變化，以分析耐藥情況。對89株耐藥結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行11種抗結(jié)核藥物耐藥基因檢測，和傳統(tǒng)的表型檢測標(biāo)準(zhǔn)相比較，結(jié)果表明鏈霉素、卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素藥物表型和已知突變基因型檢測具有較高的一致性，已知鏈霉素耐藥突變類型rp slA128G、rpslA263G、rrsC517T、rrsA513C與 基因檢測一致性為100%。已知二線氨基糖苷類藥物（卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素）耐藥突變類型rrsA1401G、rrsG1484T與基因檢測一致性為100%。

推測突變類型rpslA128G、rpslA263G、rrs C517T、rrsA513C只與鏈霉素耐藥相關(guān)。突變類型rrsA1401G、rrsG1484T與鏈霉素、卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素交叉耐藥相關(guān)。突變類型rrsC1456T與鏈霉素耐藥相關(guān)，突變類型尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報道，為新的突變位點(diǎn)。