歐前胡素對(duì)小鼠急性肺損傷的影響及其機(jī)制研究

華俊萍，王宋平

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 呼吸一科，四川 瀘州 646000）

急性肺損傷是由各種因素導(dǎo)致的急性彌漫性肺損傷，其特點(diǎn)是肺實(shí)質(zhì)過(guò)度的急性炎癥反應(yīng)[1]。急性肺損傷發(fā)病率、病死率高，在全世界重癥監(jiān)護(hù)室其發(fā)病率約占10%，盡管近年對(duì)該疾病的研究有所進(jìn)展，但大多數(shù)研究表明其病死率仍高達(dá)30%～40%[2-3]。目前該病的治療重點(diǎn)是肺保護(hù)性通氣，尚無(wú)特定的藥物治療該疾病[4]。因此迫切需要探索新的藥物治療急性肺損傷。

脂多糖是革蘭陰性菌外膜的關(guān)鍵成分，是包括急性肺損傷在內(nèi)的各種炎癥疾病最常見(jiàn)的致病因素之一，常用于急性肺損傷模型的復(fù)制[4-5]。氧化應(yīng)激是急性肺損傷的重要發(fā)病機(jī)制之一，脂多糖可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧類（reactive oxygen species, ROS）的產(chǎn)生，進(jìn)而產(chǎn)生大量腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等細(xì)胞因子，對(duì)肺組織造成損傷[5]。ROS 是重要的調(diào)節(jié)因子，在急性肺損傷中起重要作用，通常被認(rèn)為是激活下游信號(hào)級(jí)聯(lián)而擴(kuò)展炎癥的次級(jí)信使[5-7]。因此，阻斷ROS 的產(chǎn)生或作用可能對(duì)急性肺損傷等炎癥疾病有治療價(jià)值。

歐前胡素是呋喃香豆素的衍生物之一，存在于多種中藥材中，具有抗炎、抗菌等多種生物活性，體內(nèi)外有研究表明其對(duì)炎癥疾病有保護(hù)作用[8-10]。歐前胡素在體內(nèi)是否抑制脂多糖誘導(dǎo)的ROS，進(jìn)而抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/核轉(zhuǎn)錄因子κB（PI3K/Akt/NF-κB）通路對(duì)炎癥疾?。ㄈ缂毙苑螕p傷等）起到保護(hù)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)脂多糖復(fù)制急性肺損傷模型，探究歐前胡素對(duì)急性肺損傷的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)健康雌性BALB/c 小鼠32 只[動(dòng)物室注冊(cè)批文號(hào)： SCXK（湘）2016-0002]，6 周齡，體重（20±2）g，購(gòu)自重慶萊彼特生物科技有限公司，動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)方案均嚴(yán)格按照西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)范執(zhí)行。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器歐前胡素購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司，脂多糖（LPS）、ROS 檢測(cè)熒光探針DHE 購(gòu)自上海Sigma 生物公司，髓過(guò)氧化物酶（MPO）試劑盒購(gòu)自南京建成公司，小鼠IL-1β 和TNF-α ELISA 試劑盒購(gòu)自武漢ELK Bio 公司，PI3K、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子κB（p-NF-κB）、Akt、NF-κB 抗體購(gòu)自上海CST 公司，磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）抗體購(gòu)自上海Abcam 公司，電泳儀購(gòu)自北京市六一儀器廠，酶標(biāo)儀購(gòu)自山東Diatek 公司。

1.2 方法

1.2.1 急性肺損傷模型的復(fù)制健康雌性BALB/c小鼠32 只，喂養(yǎng)于12 h 明暗循環(huán)的清潔級(jí)動(dòng)物房，可自由獲取食物和水。適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（Control 組）、模型組（LPS 組）、歐前胡素30 mg/kg 組（LPS+IMP 30 mg/kg 組）歐前胡素60 mg/kg 組（LPS+IMP 60 mg/kg 組），每組8 只小鼠。參照文獻(xiàn)[11]的方法復(fù)制急性肺損傷動(dòng)物模型，LPS+IMP 30 mg/kg 組、LPS+IMP 60 mg/kg 組分別腹腔注射歐前胡素30 和60 mg/kg，Control 組、LPS 組腹腔注射相應(yīng)體積3%二甲基亞砜溶液。1 h 后各組小鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛（10%，4 mg/kg）[12]麻醉，LPS 組、LPS+IMP 30 mg/kg 組、LPS+IMP 60mg/kg 組小鼠經(jīng)鼻滴入含10 μg 脂多糖的50 μl 磷酸鹽緩沖液（PBS）中，Control 組小鼠經(jīng)鼻滴入相應(yīng)體積的PBS。

1.2.2 肺組織的采集模型復(fù)制7 h 后，脫臼處死各組小鼠，小鼠固定于手術(shù)板上，暴露胸腔無(wú)菌條件下迅速取出肺組織，并冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 肺濕/干重比取左肺用濾紙擦干后置于玻璃試管中稱重，獲得肺組織濕重；然后將其放置在70℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中連續(xù)干燥、稱重，直至肺組織重量不再變化，獲得肺組織干重；計(jì)算肺濕重與干重之比，評(píng)價(jià)肺組織水腫。

1.2.4 肺組織病理學(xué)變化取小鼠右肺固定于4%多聚甲醛中，經(jīng)脫水、石蠟包埋后進(jìn)行4 μm 連續(xù)切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色。參照文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行小鼠肺組織病理?yè)p傷評(píng)分。

1.2.5 ROS 檢測(cè)配置二甲基亞砜溶解ROS 檢測(cè)熒光探針DHE 為5 mmol/L 的溶液，避光放置備用；使用前將溶液按照1 ∶1 000 稀釋后備用；取冷凍保存的右肺組織切片；制片后，將稀釋好的探針溶液滴加到組織，37℃孵育30 min；PBS 洗去多余探針溶液，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 MPO 活力檢測(cè)取右肺組織制備肺組織勻漿，用MPO 測(cè)試盒檢測(cè)MPO 活力，參照該試劑盒說(shuō)明書(shū)分別取肺組織勻漿上清及相應(yīng)試劑于對(duì)照管及測(cè)定管中混勻，37℃水浴30 min，再加入相應(yīng)試劑混勻，60℃水浴10 min，取出后立即在波長(zhǎng)460 nm 處測(cè)量各管的光密度（OD）值。MPO 活力（u/g 組織濕重）=（測(cè)定OD 值-對(duì)照OD 值）/[11.3×取樣量（g）]。

1.2.7 TNF-α、IL-1β 含量檢測(cè)取肺組織勻漿上清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)TNF-α、IL-1β 水平，按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)分別將100 μl稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣品加入96 孔的聚乙烯板中，37℃孵育2 h，棄掉樣品，加洗滌緩沖液洗滌3 次；分別在相應(yīng)的96 孔板中每孔加入100 μl 生物素化的TNF-α、IL-1β 抗體工作液，37℃孵育1 h；分別在相應(yīng)的96 孔板中每孔加入100 μl 鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶，37℃孵育1 h；分別在相應(yīng)的96 孔板中每孔加入90 μl 四甲基聯(lián)苯胺底物稀釋溶液，避光放置15 min；每孔加入50 μl 終止液；用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm 處測(cè)量OD 值；計(jì)算TNF-α、IL-1β 的濃度。

1.2.8 Western blotting采用Western blotting 檢測(cè)p-PI3K、p-Akt、p-NF-κB、PI3K、Akt、NF-κB、MMP-9 蛋白水平，提取右肺組織總蛋白并檢測(cè)蛋白濃度，然后電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，加入一抗4℃封閉蛋白質(zhì)過(guò)夜，第2 天棄去一抗，加入酶標(biāo)羊抗兔二抗，滴加化學(xué)發(fā)光液，曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步的兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 歐前胡素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺濕/干重比的影響

各組小鼠肺濕/干重比比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。LPS組高于Control 組（P＜0.05）；LPS+IMP 30mg/kg 組、LPS+IMP 60mg/kg 組低于LPS 組（P＜0.05）；LPS+IMP 60mg/kg 組低于LPS+IMP 30mg/kg 組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 歐前胡素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺組織病理學(xué)變化的影響

Control組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁未見(jiàn)明顯充血，肺泡間隔內(nèi)無(wú)水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔清晰，無(wú)蛋白、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；與Control 組比較，LPS 組正常肺組織結(jié)構(gòu)喪失，肺泡間隔增厚，可見(jiàn)水腫、充血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔減少；LPS+IMP 30mg/kg 組、LPS+IMP 60mg/kg 組可見(jiàn)部分正常肺組織結(jié)構(gòu)，肺泡間隔增厚，水腫、充血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較LPS 組減輕，LPS+IMP 60mg/kg 組肺組織損傷較LPS+IMP 30mg/kg 組輕。各組肺組織損傷評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。LPS 組高于Control 組（P＜0.05）；LPS+IMP 30mg/kg 組、LPS+IMP 60mg/kg 組低于LPS組（P＜0.05）；LPS+IMP 60mg/kg 組 低 于LPS+IMP 30mg/kg 組（P＜0.05）。見(jiàn)圖1和表2。

表1 各組小鼠肺濕/干重比的比較 （%，±s）

表1 各組小鼠肺濕/干重比的比較 （%，±s）

注： ①與Control 組比較，P ＜0.05；②與LPS 組比較，P ＜0.05；③與LPS+IMP 30 mg/kg 組比較，P ＜0.05。

組別 肺濕/干重比Control 組 14.93±3.65 LPS 組 39.05±3.73①LPS+IMP 30 mg/kg 組 25.82±4.99②LPS+IMP 60 mg/kg 組 19.61±3.60②③F 值 23.063 P 值 0.000

2.3 歐前胡素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺組織ROS 相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

小鼠肺組織ROS 相對(duì)熒光強(qiáng)度各組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。LPS 組肺組織較Control 組高（P＜0.05）；LPS+IMP 60mg/kg 組、LPS+IMP 30mg/kg組較LPS 組低（P＜0.05）；LPS+IMP 60mg/kg 組較LPS+IMP 30mg/kg 組低（P＜0.05）。見(jiàn)圖1和表2。

2.4 歐前胡素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺組織MPO 的影響

各組小鼠肺組織MPO 活力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。LPS 組較Control組高（P＜0.05）；LPS+IMP 30mg/kg 組較LPS 組低；LPS+IMP 60mg/kg 組較LPS 組低（P＜0.05）；LPS+IMP 60mg/kg組較LPS+IMP 30mg/kg 組低（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

圖1 各組小鼠肺組織（HE 染色×200）與ROS 水平（HE 染色×400）

表2 各組小鼠肺組織損傷評(píng)分及ROS 相對(duì)熒光強(qiáng)度的比較 （±s）

表2 各組小鼠肺組織損傷評(píng)分及ROS 相對(duì)熒光強(qiáng)度的比較 （±s）

注： ①與Control 組比較，P ＜0.05；②與LPS 組比較，P ＜0.05；③與LPS+IMP 30mg/kg 組比較，P ＜0.05。

組別 肺組織損傷評(píng)分 ROS 相對(duì)熒光強(qiáng)度/%Control 組 0.67±0.33 0.00±0.00 LPS 組 10.67±0.33① 92.58±1.19①LPS+IMP 30 mg/kg 組 7.22±0.51② 66.10±11.09②LPS+IMP 60 mg/kg 組 4.67±0.67②③ 49.46±5.22②③F 值 66.591 97.075 P 值 0.000 0.000

2.5 歐前胡素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺組織IL-1、TNF-α 的影響

各組小鼠肺組織IL-1β、TNF-α 細(xì)胞因子水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。LPS 組較Control 組高（P＜0.05）；LPS+IMP 30mg/kg 組、LPS+IMP 60mg/kg組較LPS 組低（P＜0.05）；LPS+IMP 60mg/kg 組較LPS+IMP 30mg/kg 組低（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

2.6 歐前胡素抑制ROS 介導(dǎo)的PI3K/Akt/NF-κB通路活化及對(duì)MMP-9 蛋白表達(dá)的影響

各組小鼠肺組織中p-PI3K、p-Akt、p-NF-κB p65、MMP-9 蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。LPS 組較Control 組高（P＜0.05）；與LPS 組比 較，LPS+IMP 30mg/kg 組、LPS+IMP 60mg/kg 組 較低（P＜0.05）；LPS+IMP 60mg/kg 組較LPS+IMP30 mg/kg組低（P＜0.05）（見(jiàn)表5）。各組間Akt、PI3K、NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化（見(jiàn)圖2）。

表3 各組小鼠MPO 活力的比較 （±s）

表3 各組小鼠MPO 活力的比較 （±s）

注： ①與Control 組比較，P ＜0.05；②與LPS 組比較，P ＜0.05；③與LPS+IMP 30 mg/kg 組比較，P ＜0.05。

組別 MPO 活力（u/g 組織濕重）Control 組 0.69±0.09 LPS 組 1.54±0.23①LPS+IMP 30 mg/kg 組 1.28±0.06②LPS+IMP 60 mg/kg 組 0.78±0.22②③F 值 15.547 P 值 0.000

表4 各組小鼠肺組織IL-1、TNF-α 水平的比較（pg/ml，±s）

表4 各組小鼠肺組織IL-1、TNF-α 水平的比較（pg/ml，±s）

注： ①與Control 組比較，P ＜0.05；②與LPS 組比較，P ＜0.05；③與LPS+IMP 30 mg/kg 組比較，P ＜0.05。

組別 IL-1β TNF-α Control 組 41.68±4.58 93.40±4.67 LPS 組 132.45±17.25① 226.71±31.99①LPS+IMP 30 mg/kg 組 76.80±15.11② 156.36±16.05②LPS+IMP 60 mg/kg 組 66.32±9.56②③ 125.31±7.08②③F 值 25.573 26.345 P 值 0.000 0.000

表5 各組小鼠p-PI3K、p-Akt、p-NF-κB p65、MMP-9 蛋白表達(dá)水平的比較 （±s）

表5 各組小鼠p-PI3K、p-Akt、p-NF-κB p65、MMP-9 蛋白表達(dá)水平的比較 （±s）

注： ①與Control 組比較，P ＜0.05；②與LPS 組比較P ＜0.05；③與LPS+IMP 30 mg/kg 組比較，P ＜0.05。

組別 p-PI3K p-Akt p-NF-κB p65 MMP-9 Control 組 0.05±0.00 0.04±0.00 0.04±0.01 0.07±0.03 LPS 組 0.64±0.16① 0.40±0.06① 0.62±0.10① 0.58±0.08①LPS+IMP 30mg/kg 組 0.43±0.06② 0.23±0.01② 0.39±0.02② 0.31±0.06②LPS+IMP 60mg/kg 組 0.15±0.08②③ 0.08±0.03②③ 0.16±0.02②④ 0.14±0.01②③F 值 19.922 42.573 60.740 49.247 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖2 各組小鼠肺組織中p-PI3K、p-Akt、p-NF-κB p65、MMP-9 蛋白表達(dá)水平情況

3 討論

急性肺損傷是由各種肺內(nèi)外致病因素引起的危及生命的疾病，肺部過(guò)度急性彌漫性炎癥反應(yīng)是其主要特點(diǎn)，導(dǎo)致肺泡上皮和內(nèi)皮屏障功能障礙，彌漫性肺泡損傷，肺泡腔滲出富含蛋白質(zhì)的液體，肺泡出血，肺水腫，進(jìn)而肺容積減少，肺順應(yīng)性降低等[14]。本研究結(jié)果顯示，LPS 組肺濕/干重比高于Control 組，提示肺水腫，HE 染色示LPS 組正常肺組織結(jié)構(gòu)喪失，肺泡間隔增厚，充血及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔減少，支氣管腔內(nèi)見(jiàn)蛋白及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，提示急性肺損傷[15]，而歐前胡素預(yù)處理上述病理變化有所減輕，表現(xiàn)出對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷有保護(hù)作用，且歐前胡素高劑量組效果優(yōu)于低劑量組。中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)是急性肺損傷的特征之一，其可通過(guò)脫顆粒釋放出殺菌蛋白，同時(shí)釋放細(xì)胞因子、ROS，以及中性粒細(xì)胞外陷阱的產(chǎn)生對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展起重要作用。MPO 由中性粒細(xì)胞分泌，可用于評(píng)估中性粒細(xì)胞在肺組織中的積聚[16-17]。本研究顯示脂多糖刺激使急性肺損傷小鼠肺組織中MPO 活力升高，中性粒細(xì)胞在肺組織中大量積聚，而歐前胡素預(yù)處理使MPO 活力降低，中性粒細(xì)胞在肺組織中積聚減少，且歐前胡素劑量高者優(yōu)于劑量低者。

基質(zhì)金屬蛋白酶是一組鋅依賴的內(nèi)肽酶，參與急性肺損傷的發(fā)生，MMP-9 屬于明膠酶亞類，MMP-9 是已知的降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分。MMP-9 從活化的中性粒細(xì)胞中釋放，其可降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，包括細(xì)胞間連接蛋白、基底膜和將細(xì)胞錨定在基底膜上的蛋白質(zhì)，從而增加肺泡毛細(xì)血管通透性，介導(dǎo)炎癥細(xì)胞向肺泡間隙的遷移，蛋白滲漏，肺組織細(xì)胞外間隙含水量增加，導(dǎo)致肺結(jié)構(gòu)的廣泛改變，其還可活化細(xì)胞因子、趨化因子等，最終放大氣道炎癥。有研究顯示減低MMP-9 對(duì)急性肺損傷有保護(hù)作用[16，18-20]。TNF-α、IL-1β 等在急性肺損傷中起重要作用，可啟動(dòng)、放大和維持急性肺損傷的炎癥反應(yīng)[16]。據(jù)報(bào)道，IL-1β 可引起促炎細(xì)胞因子和趨化因子產(chǎn)生，炎癥細(xì)胞聚集，減少上皮鈉通道，改變內(nèi)皮-上皮屏障通透性和液體運(yùn)輸，導(dǎo)致肺水腫等造成急性肺損傷[21-22]。TNF-α 是炎癥反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子，失調(diào)的TNF-α信號(hào)使細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激、壞死及凋亡，刺激白細(xì)胞在損傷和感染部位的積累、增殖和分化，激活組織中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞，該活化的炎癥細(xì)胞又可分泌TNF-α 和其他促炎細(xì)胞因子，趨化因子等造成急性肺損傷[6，23]。本研究顯示，脂多糖刺激使MMP-9 蛋白表達(dá)水平升高，小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β 水平升高，而歐前胡素預(yù)處理使MMP-9 蛋白表達(dá)水平降低，TNF-α、IL-1β 的釋放減少，LPS+IMP 60 mg/kg組效果優(yōu)于LPS+IMP 30 mg/kg 組。表明歐前胡素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷的保護(hù)作用可能與降低MMP-9 蛋白表達(dá)及減少TNF-α、IL-1β 的釋放，進(jìn)而減輕肺組織水腫、蛋白滲出、炎癥細(xì)胞的遷移積聚，減少細(xì)胞因子等的釋放活化有關(guān)。

ROS 包括羥基自由基、超氧物和過(guò)氧化氫氧自由基，主要由還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶參與產(chǎn)生[24]。ROS 在炎性疾病中，尤其是急性肺損傷中起重要的作用，是擴(kuò)展炎癥的次級(jí)信使[5]。ROS 還可介導(dǎo)PI3K/Akt/NF-κB 通路激活增加炎癥細(xì)胞因子等的釋放[5，10]。PI3K/Akt 通路是炎癥反應(yīng)的重要信號(hào)級(jí)聯(lián)，是NF-κB 的上游分子，可使NF-κB 激活[25-27]。有研究顯示抑制PI3K/Akt 的磷酸化，對(duì)急性肺損傷有保護(hù)作用[5，28]。NF-κB 在炎癥的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用[26，29]，NF-κB家族包括NF-κB1（p105/p50）、NFκB1（p100/p52）、RelA（p65）、c-Rel 和RelB，其都包含有介導(dǎo)二聚化，DNA 結(jié)合，核定位的Rel 同源結(jié)構(gòu)域，僅RelA（p65）、c-Rel 和RelB 包含有靶基因表達(dá)所必需的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，NF-κB 家族中的各成員間可以彼此締合成各種異二聚體和同二聚體[10]。NF-κB 常由p50/p65 亞基組成，調(diào)控炎癥反應(yīng)[5]。RelA（p65）的核易位使炎癥細(xì)胞因子等基因表達(dá)[1]，從而導(dǎo)致TNF-α、IL-1β 等細(xì)胞因子的生成及MMP-9 蛋白的表達(dá)。該研究顯示，歐前胡素預(yù)處理可使脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺組織中ROS 水平降低，PI3K/Akt/NF-κB 通路磷酸化水平降低，有體外研究表明歐前胡素可抑制ROS 介導(dǎo)的PI3K/Akt/NF-κB 通路激活[10]，表明歐前胡素可能是通過(guò)阻斷脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷中的ROS，以及阻斷ROS介導(dǎo)的PI3K/Akt/NF-κB 通路激活有關(guān)，對(duì)急性肺損傷表現(xiàn)出保護(hù)作用。而TNF-α、IL-1β 對(duì)TNF-α、IL-1β 起正反饋?zhàn)饔?，使NF-κB 激活增加，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放，從而放大炎癥反應(yīng)[30]。該研究表明，歐前胡素預(yù)處理可減低細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β 等的釋放，從而減少其對(duì)NF-κB 的正反饋?zhàn)饔茫瑴p少細(xì)胞因子的進(jìn)一步增加，減少炎癥反應(yīng)的瀑布效應(yīng)，對(duì)急性肺損傷起保護(hù)作用。

綜上所述，與Control 組比較，LPS 組脂多糖刺激可致急性肺損傷，使肺組織水腫，肺泡完整性破壞，蛋白及炎癥細(xì)胞滲出，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔減少，并使細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β 的釋放增加，MMP-9的表達(dá)水平升高，提高ROS 水平，提高PI3K、Akt、NF-κB p65 的磷酸化；而歐前胡素預(yù)處理可使脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺組織中ROS 水平降低，降低PI3K、AKT、NF-κB p65 的磷酸化，減少細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β 的釋放，降低MMP-9 的表達(dá)水平，從而減輕肺水腫，減輕中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕肺組織病理變化，減輕小鼠急性肺損傷。因此，歐前胡素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷有保護(hù)作用，其可能與減少細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β 的釋放，降低MMP-9的表達(dá)水平有關(guān)，其作用機(jī)制可能與脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷中ROS 被抑制，以及ROS 介導(dǎo)的PI3K/Akt/NF-κB 通路被抑制有關(guān)。該實(shí)驗(yàn)存在一定的局限： ①樣本量偏小，但本實(shí)驗(yàn)中該樣本量仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，下一步可增大樣本量進(jìn)一步研究；②歐前胡素是否通過(guò)其他機(jī)制對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用有待進(jìn)一步探索。該實(shí)驗(yàn)為歐前胡素治療急性肺損傷提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。