Taqman探針RT-qPCR法檢測柑橘黃龍病與海南柑橘主產(chǎn)區(qū)黃龍病現(xiàn)狀

李 歡， 康秀晗， 李德飛， 陳惠查， 黃家權(quán)

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)作物品種資源研究所， 貴州 貴陽 550006； 2.海南省眾邑新材料研究院有限公司， 海南 三亞 572025； 3.海南大學(xué) 熱帶作物學(xué)院海南省熱帶生物可持續(xù)利用重點實驗室， 海南 ?？?570228； 4.貴州省威寧自治縣黑石頭鎮(zhèn)第二小學(xué)， 貴州 威寧 553105)

柑橘黃龍病(HLB)又叫青果病，是世界柑橘生產(chǎn)中毀滅性的病害之一，有柑橘“癌癥”之稱，感病果園通常在5～8年內(nèi)就會全園覆滅，目前該病已在全球超過40多個國家和地區(qū)流行[1]。黃龍病的病原物是一種難以培養(yǎng)的韌皮部桿菌屬革蘭氏陰性菌[2]，目前已知的黃龍病菌有亞洲種(CandidatusLiberibacter asiaticus，Las)、非洲種(Ca. L. africanus, Laf)和美洲種(Ca. L. americanus, Lam)3個種[3]，其中Las分布最廣，也是我國柑橘黃龍病發(fā)生的致病種[4]。柑橘黃龍病主要通過帶病接穗嫁接和柑橘木虱交叉取食傳播[5]，其中Las和Lam主要通過亞洲柑橘木虱(Diaphorinacitri)、Laf主要通過非洲柑橘木虱(Triozaerytreae)傳播[6]。目前對柑橘黃龍病的病原菌雖已有統(tǒng)一的認識，但由于黃龍病菌尚未實現(xiàn)體外人工培養(yǎng)，對其生物學(xué)特性知之甚少，導(dǎo)致抗病品種和有效藥劑缺乏，對柑橘黃龍病的控制僅限于預(yù)防水平。同時，柑橘黃龍病典型癥狀包括果實出現(xiàn)“紅鼻子果”[7]、葉片均勻或斑駁黃化[1]等，這與一些缺鋅、缺鎂等缺素癥，以及病毒病危害癥狀相似，因此，黃龍病癥狀診斷具有較大的主觀性。建立快速、有效、準確的分子檢測和診斷方法，有助于及早清除病原，防止黃龍病擴散蔓延。同時，研究黃龍病菌在不同自然氣候條件下寄主植物體內(nèi)的分布和含量水平，有助于加深對其生物學(xué)特性及其在寄主植物體內(nèi)擴散定殖特性和致病機理的研究。

由于病原菌在宿主植株內(nèi)的低含量、不均勻分布等，使得傳統(tǒng)的PCR方法對黃龍病菌在宿主植株或者昆蟲體內(nèi)的持續(xù)檢測無論是在準確性還是靈敏性等方面都存在缺陷[8-9]。LI等[10]的研究表明：利用Taqman探針的實時熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qPCR)技術(shù)檢測黃龍病菌與傳統(tǒng)PCR相比，具有高靈敏度、特異性、準確性和穩(wěn)定性，高重復(fù)率和低污染等優(yōu)點，且RT-qPCR可對DNA進行定性定量的檢測和分析，因此該方法是研究確診與檢測黃龍病菌在宿主植株體內(nèi)含量和分布的有效手段。TEIXEIRA等[11]在圣保羅州和巴西兩地對甜橙葉片進行黃龍病美洲種(Lam)的檢測后發(fā)現(xiàn)，其在葉片中分布不均，在無癥狀的葉片中未檢測出黃龍病菌，而在斑駁型黃化癥狀的葉片中檢測出較高濃度的黃龍病菌，中脈組織中平均含量達到107個/g。TATINENI等[12]發(fā)現(xiàn)感病柑橘根、皮、葉、花、果實中均含有黃龍病菌，而在種子胚胎和胚乳中未能發(fā)現(xiàn)。LI等[13]研究發(fā)現(xiàn)黃龍病菌可以感染柑橘植株多個組織，且在不同組織中含量差異巨大，地上部組織中平均含量達1010個/g，病菌含量從接種位點向上下兩側(cè)逐漸蔓延增多。

我國南方地區(qū)柑橘黃龍病發(fā)生嚴重，隨著海南省柑橘種植面積的不斷擴大，面臨的潛在威脅也越來越大。針對海南省柑橘黃龍病的發(fā)生狀況，筆者參考LI等[10]的方法，以植物細胞色素氧化酶(COX)引物探針組(COXfpr)為內(nèi)參，用黃龍病特異的引物探針組(HLBaspr)對海南省不同品種、不同組織部位的Las進行實時熒光定量檢測分析，以期建立一種不依賴于癥狀的高準確性HLB分子診斷方法，了解海南省柑橘黃龍病的整體分布概況，供研究黃龍病菌在柑橘體內(nèi)發(fā)生發(fā)展規(guī)律參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年4—5月對海南省臨高縣新盈農(nóng)場的5年生紅肉蜜柚、澄邁縣福山果園的10年生紅江橙各選4株疑似黃龍病株，每株按新葉、老葉、新梢、莖稈、次級根、主根等分部位取樣，其中葉片按顯癥(斑駁黃化型)和不顯癥(表型正常)分類采集；對瓊中縣、屯昌縣、儋州市的柑橘園各選4株疑似黃龍病株的顯癥或不顯癥葉片取樣，并以瓊中縣苗圃基地種植于溫室大棚的紅江橙作陰性對照。

1.2 樣品總DNA提取

用清水將植株組織沖洗干凈，分別稱取200 mg(葉片取中脈，新梢、莖稈取表皮)。采用TIANGEN公司生產(chǎn)的新型植物基因組DNA提取試劑盒(DNAsecure Plant Kit，DP320)提取各組織樣品的DNA，懸浮于150 μL TE洗脫緩沖液中，-20℃保存待用。用Nanodrop 2000-超微量分光光度計測定提取的DNA濃度。

1.3 RT-qPCR檢測病原菌

qPCR參照LI等[10]的方法并稍作修改。黃龍病引物為HLBas/HLBr，探針為HLBp；內(nèi)參基因引物為COXf/COXr，探針為COXp。反應(yīng)體系為20 μL: 2×Premix Ex Taq(Probe qPCR) : 10 μL，250 nM黃龍病引物HLBas/HLBr:各0.5 μL，150 nM探針HLBp:0.3 μL，300 nM內(nèi)參引物COXf/COXr:各0.3 μL，150 nM內(nèi)參探針:0.3 μL，DNA模板:5 μL。擴增程序為：95℃變性20 s，然后95℃ 1 s，58℃ 40 s，共50個循環(huán)。每個DNA樣品重復(fù)測定3次，每次測定均帶1個空白對照、陽性對照和陰性對照。使用德國QIAGEN生產(chǎn)的Rotor-Gene Q儀器進行Rt-qPCR，各引物和探針均由上海生工生物股份有限公司合成，qPCR試劑購自日本TaKaRa公司。

1.4 Las濃度計算

采用LI等[14]的廣譜線性回歸方程：Y=13.82-0.286 6X對Las進行定量分析。其中Y代表DNA模板濃度的Lg值，X代表RT-qPCR后的熒光閾值(CT值)，由于qPCR中5 μL的DNA模板是從200 mg植株組織中提取的并懸浮于150 μL TE洗脫緩沖液中，且基于Las 16S rDNA設(shè)計的序列中，每個病原菌細胞中含有2份靶DNA，故最終Las的濃度為10Y×150×5/2(個/g)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007和SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，應(yīng)用Duncan法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-qPCR檢測Las

對感染了Las的臨高紅肉蜜柚樣品DNA進行10倍的連續(xù)濃度梯度100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀釋(表1)后進行qPCR。檢測結(jié)果表明：HLBaspr引物探針組在DNA稀釋到10-5時，每5 μL DNA中仍能檢測到Las(圖1)，而稀釋到10-6時則收集不到熒光信號。因此，使用HLBaspr引物探針組對黃龍病的檢測下限為10-5稀釋度，相當(dāng)于每67 ng新鮮葉片中脈組織中含有一個靶DNA(200 mg÷150 μL×10-5×5 μL)，即Las在葉中脈組織的含量約1.49×107份DNA/g。

表1 實時熒光定量PCR(Taqman)的靈敏度檢測

2.2 Las在紅肉蜜柚和紅江橙各部位中的含量

對臨高縣的紅肉蜜柚和澄邁縣的紅江橙2品種各3株疑似黃龍病感病植株按主根、次級根、莖、新梢、老葉、新葉6個部位取樣進行qPCR。檢測結(jié)果(表2)表明：紅肉蜜柚和紅江橙植株各部位均可檢測出Las病原菌，且各部位Las的含量差異較大。紅肉蜜柚各部位Las的含量從次級根、老葉、主根、新葉、莖、新梢依次降低，差異水平在4個數(shù)量級內(nèi)變化(圖2)，變化范圍從1×107個/g～3×1011個/g，其中次級根含量達2.31×1011個/g，新梢含量為1.15×107個/g；紅江橙各部位Las含量從新葉、老葉、新梢、莖、次級根、主根依次降低，差異水平在3個數(shù)量級內(nèi)變化，變化范圍從1×109個/g～4×1011個/g，其中新葉含量達3.65×1011個/g，主根含量為1.51×109個/g。從整體結(jié)果看，紅肉蜜柚各部位COXfpr的CT值較穩(wěn)定且正常，而紅江橙主根和次級根COXfpr的CT值偏高，這可能與感病植株部分根死亡，DNA被降解，致檢測條件下的基因組DNA的濃度相對較低有關(guān)。

表2 RT-qPCR 定量檢測紅肉蜜柚和紅江橙不同組織中黃龍病菌的循環(huán)閾值及其含量

2.3 黃龍病顯癥與不顯癥葉片中Las的含量

對采自臨高縣的紅肉蜜柚和澄邁縣的紅江橙2個品種的斑駁黃化型與表型正常的老葉、新葉中脈進行qPCR檢測結(jié)果表明(圖3)：2個品種的新葉和老葉中脈均能檢測出Las，且斑駁黃化型葉片Las含量高于表型正常葉片，含量差異在老葉中表現(xiàn)得尤為突出，斑駁黃化型較表型正常老葉高出104～106倍，新葉則僅高出10～100倍。紅江橙新葉Las含量高于紅肉蜜柚，老葉中二者含量相差不大。

2.4 海南省柑橘黃龍病的qPCR檢測

采用Taqman探針RT-qPCR法對海南省瓊中縣、澄邁縣、屯昌縣、臨高縣、儋州市等柑橘主產(chǎn)區(qū)主栽的紅肉蜜柚、水晶蜜柚、甜橙、福橙、檸檬等品種的疑似黃龍病樣品進行檢測的結(jié)果表明(表3)：在主產(chǎn)區(qū)采集的23個疑似黃龍病樣品DNA樣品中，只有來自儋州市的其中1份水晶蜜柚樣品檢測呈陰性，其余的樣品中均檢測出了黃龍病菌，Ct值介于16～31.78。說明海南省柑橘主栽區(qū)均受到了不同程度的黃龍病菌危害。

表3 RT-qPCR對海南省柑橘黃龍病疑似樣品檢測循環(huán)閾值

3 結(jié)論與討論

1) 本研究應(yīng)用Taqman探針qPCR法在海南省感病紅肉蜜柚和紅江橙的主根、次級根、莖、新梢、老葉、新葉等6個組織中都檢測出Las，且Las在各組織或同一組織不同品種間的含量差異較大，與TATINENI等[12]、LI等[13]、婁兵海等[15]研究的分布、定殖特性一致。LI[13]的研究表明Las的含量在103范圍內(nèi)波動，不同組織中平均含量介于7×108～2×1011個/g，而本研究發(fā)現(xiàn)Las在不同組織中含量差異顯著，平均含量在104個/g范圍內(nèi)波動，介于1×107～3×1011個/g，且紅肉蜜柚中次級根的Las含量最高，紅江橙新葉中脈的Las含量最高，原因可能是由于柑橘品種以及所處發(fā)病時期不同引起的差異。TEIXEIRA等[11]對斑駁黃化型和表型正常型葉片進行了Lam的檢測，發(fā)現(xiàn)在不同顯癥葉片中黃龍病菌分布差異巨大，且斑駁黃化型葉片含量較高，與本研究結(jié)果相一致。但TEIXEIRA等[11]的研究僅在斑駁黃化型葉片中檢測到Lam，而在無癥狀葉片中并未檢測出，本研究在紅肉蜜柚和紅江橙2個品種的斑駁黃化型和表型正常型的新葉和老葉中均檢測出了Las，且斑駁黃化型葉片Las含量均高于表型正常葉片，該結(jié)果的差異可能是試驗品種、取樣時間和檢測方法不同導(dǎo)致。

2) 黃龍病葉片是否斑駁黃化和有“紅鼻子”果出現(xiàn)，通常是田間快速診斷的依據(jù)，但LOPES等[16]研究認為，斑駁黃化癥狀在高溫時會消退而影響診斷。LI等[10]、胡浩等[17]研究表明，Taqman探針法較傳統(tǒng)的PCR和SYBR Green I熒光染料法有更高的靈敏度、特異性和準確性，本研究采用Taqman探針法檢測Las的極限為10-5稀釋度，與LI等[10]的結(jié)果一致，而與胡浩等[17]的檢測極限10-8稀釋度存在差異，可能是因品種差異造成。

3) 關(guān)于Las的濃度計算，采用LI等[14]證明的對不同地區(qū)、不同柑橘品種和不同組織部位都適用的廣譜線性回歸方程進行定量。ZHANG等[18]研究認為，使用該定量方法，當(dāng)CT值大于36.0時，即視為檢測結(jié)果為陰性。本次檢測中僅1份樣品(儋州水晶蜜柚CT= 38.55)CT值大于36.0，即檢測結(jié)果為陰性，可認為該樣品尚未感染黃龍病菌。

4) 海南省是優(yōu)良柑橘種植區(qū)，柑橘產(chǎn)業(yè)是拉動地方經(jīng)濟發(fā)展不可或缺的產(chǎn)業(yè)，因此對柑橘黃龍病這種毀滅性病害進行檢測，為預(yù)防該病流行有深遠意義。檢測發(fā)現(xiàn)Las已在海南各柑橘產(chǎn)區(qū)出現(xiàn)，且情況嚴重。本研究使用的Taqman探針RT-qPCR法可快速、精準的檢測海南省柑橘Las，可作為一種穩(wěn)定可靠的檢驗檢疫技術(shù)推廣應(yīng)用。