山東省牛傳染性鼻氣管炎流行病學(xué)調(diào)查

文│白明月（山東省禹城市畜牧業(yè)發(fā)展中心）

牛傳染性鼻氣管炎（Infectious Bovine Rhinotracheitis，IBR）又稱紅鼻病，是由牛傳染性鼻氣管炎病毒（Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus，IBRV）引起的一種主要發(fā)生在牛的傳染病，主要特征是高熱、流鼻液，隨后發(fā)展為呼吸困難等癥狀，除導(dǎo)致牛生長(zhǎng)緩慢、產(chǎn)奶量下降外，亦可造成繁殖力下降、流產(chǎn)等，同時(shí)IBRV還可引起免疫抑制，繼發(fā)其他呼吸道病原，給各國(guó)養(yǎng)牛業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。雖然IBR發(fā)病后死亡率不高，但由于其可影響國(guó)際貿(mào)易，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報(bào)告的傳染病，我國(guó)也將其列為二類動(dòng)物疫病。該病最早于1955年由Miller在美國(guó)科羅拉多的育肥牛群中發(fā)現(xiàn)，并于1956年由Madin首次分離出病毒，之后一些學(xué)者相繼在發(fā)病牛的眼結(jié)膜、腦、外陰、流產(chǎn)胎兒等組織、材料中分離出病毒，1964年Huck確認(rèn)IBRV為皰疹病毒。我國(guó)于1980年由周泰沖在新西蘭進(jìn)口奶牛中首次分離到IBRV，之后流行病學(xué)調(diào)查顯示IBR在我國(guó)廣泛流行，嚴(yán)重制約我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展。

表1 選取牛場(chǎng)相關(guān)信息

一、材料與方法

1.材料。

（1）病毒、細(xì)胞與血清。IBRV陽(yáng)性毒株由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心研究員楊宏軍饋贈(zèng)，牛胚腎細(xì)胞（MDBK）、IBR陽(yáng)性血清、陰性血清均購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（CVCC），待檢血清采集自山東省濟(jì)南、泰安、德州、東營(yíng)、濰坊、臨沂等6市共15個(gè)奶牛場(chǎng)或奶牛養(yǎng)殖小區(qū)，共計(jì)1981份樣品。上述牛場(chǎng)未暴發(fā)過(guò)IBR且均未接種包含IBRV抗原的疫苗。

（2）試驗(yàn)動(dòng)物。2～6月齡健康奶牛篩選自泰安市及周邊養(yǎng)殖場(chǎng)，要求IBRV抗原、抗體均為陰性。IBRV抗原檢測(cè)時(shí)取待檢牛的鼻拭子，浸泡于1.0毫升含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液中，低溫運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，反復(fù)凍融3次，8000r/min（r/min指每分鐘所旋轉(zhuǎn)的圈數(shù)）離心10分鐘，取上清液抽提DNA后直接PCR檢測(cè)；IBRV抗體檢測(cè)時(shí)無(wú)菌采血，析出血清后使用IBRV ELISA抗體檢測(cè)試劑盒［Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus（BHV-1） gB Antibody Test Kit］進(jìn)行檢測(cè)。

表2 不同牛場(chǎng)犢牛ELISA法檢測(cè)抗體陽(yáng)性率匯總（2016—2018年）

表3 不同牛場(chǎng)成年牛ELISA法檢測(cè)抗體陽(yáng)性率匯總（2016—2018年）

表4 不同地區(qū)ELISA法檢測(cè)抗體平均陽(yáng)性率匯總（2016—2018年）

（3）主要試劑及儀器。IBRV ELISA抗體檢測(cè)試劑盒為IDEXX公司產(chǎn)品。2×Taq Plus MasterMix（Dye）購(gòu)于康為世紀(jì)生物科技有限公司；低熔點(diǎn)瓊脂糖、中性紅染色液均為索萊寶公司產(chǎn)品；胎牛血清為Biological Industries（BI）公司產(chǎn)品。

2.試驗(yàn)方法。

（1）山東省牛傳染性鼻氣管炎流行病學(xué)調(diào)查。為了解山東省內(nèi)IBR的感染情況，本課題組在2016—2018年，連同地方畜牧獸醫(yī)局的春防秋防工作，選取濟(jì)南、泰安、德州、東營(yíng)、濰坊、臨沂等6市15個(gè)奶牛場(chǎng)開展流行病學(xué)調(diào)查，分別對(duì)15個(gè)牛場(chǎng)中2～6月齡犢牛和1歲以上成年牛（包括懷孕牛）進(jìn)行采血，犢牛采血方式為頸靜脈采血，成年牛通過(guò)尾根靜脈采血，共計(jì)采血1981份，其中犢牛采血489份，成年牛采血1492份。操作時(shí)使用10毫升注射器無(wú)菌采血5.0毫升，之后將血液負(fù)吸到促凝管中，混勻后靜置，置于4℃析出血清后收集到EP管中，56℃水浴30分鐘進(jìn)行滅活，-20℃保存待用。15個(gè)牛場(chǎng)相關(guān)信息如表1。

（2）ELISA法檢測(cè)血清樣品。按說(shuō)明書進(jìn)行操作，具體如下：

試驗(yàn)前準(zhǔn)備。將試劑盒所有組分恢復(fù)至18～26℃，并混勻；洗滌液的準(zhǔn)備：對(duì)恢復(fù)至18～26℃的洗滌液進(jìn)行10倍稀釋；取出用抗原包被的反應(yīng)板，并記錄好樣品位置；每孔加入50微升稀釋的洗滌液；分別將50微升的陰性對(duì)照加入到適當(dāng)?shù)?個(gè)孔中，分別將50微升的陽(yáng)性對(duì)照加入到適當(dāng)?shù)?個(gè)孔中，分別將50微升的被檢樣品加入到剩下的檢測(cè)孔中；將反應(yīng)板中的溶液振蕩混勻；37℃條件下孵育2小時(shí)；棄掉孔內(nèi)液體，用大約300毫升洗滌液洗滌加樣孔，共洗滌5次。每次洗滌后棄去孔內(nèi)液體，最后1次洗滌后將孔內(nèi)殘留的洗滌液排干；在每個(gè)反應(yīng)孔中加入100微升酶標(biāo)抗體；在18～26℃條件下孵育1小時(shí)；棄掉孔內(nèi)液體，用大約300毫升洗滌液洗滌加樣孔，共洗滌5次。最后1次洗滌后將孔內(nèi)殘留的洗滌液排干；在每個(gè)反應(yīng)孔中加入100微升的TMB底物溶液；在18～26℃條件下避光孵育10分鐘；在每個(gè)反應(yīng)孔中加入100微升的終止液終止反應(yīng)；在450納米波長(zhǎng)下測(cè)定樣品及陽(yáng)性、陰性對(duì)照的吸光值。

酶標(biāo)儀讀數(shù)后進(jìn)行計(jì)算，當(dāng)阻斷率＜45%時(shí)，判為樣品陰性；當(dāng)45%≤阻斷率 ＜55%時(shí)，判為可疑；當(dāng)阻斷率≥55時(shí)，判為樣品陽(yáng)性。

二、結(jié)果與分析

山東省牛傳染性鼻氣管炎流行病學(xué)調(diào)查的結(jié)果。將采集的1981份血清樣品全部使用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，濟(jì)南等6市15個(gè)牛場(chǎng)中有14個(gè)牛場(chǎng)檢測(cè)出IBRV gB抗體陽(yáng)性牛（表2、表3）。其中，濟(jì)南、泰安、德州、東營(yíng)、濰坊、臨沂等6市試驗(yàn)牛場(chǎng)的IBRV gB抗體整體平均陽(yáng)性率分別為10.2%、58.0%、12.4%、20.3%、18.5%和5.0%（表4）。通過(guò)數(shù)據(jù)分析可知，山東省的牛場(chǎng)普遍感染IBRV，但不同牛場(chǎng)的檢測(cè)結(jié)果差異較大，有些牛場(chǎng)，如TA1，犢牛與成年牛抗體檢出率都很高，而牛場(chǎng)DZ4的IBRV gB抗體檢出率則為0。試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同牛場(chǎng)犢牛、成年牛的抗體檢出率并無(wú)明顯相關(guān)性。

三、討論

1.不同牛場(chǎng)IBRV抗體存在差異的原因。經(jīng)檢測(cè)可知，不同牛場(chǎng)IBRV抗體陽(yáng)性率存在較大差異，部分牛場(chǎng)則未檢出，原因之一在于不同牛場(chǎng)采取的管理措施不同，如牛場(chǎng)TA1，未實(shí)行自繁自養(yǎng)的模式，主要從東北、內(nèi)蒙古和浙江等地引牛，犢牛的流動(dòng)性較大，在引牛的過(guò)程中不清楚當(dāng)?shù)嘏?chǎng)疫病、免疫等情況，加之長(zhǎng)途運(yùn)輸，可能導(dǎo)致牛感染IBRV或是IBRV隱形感染，之后配種產(chǎn)犢，由于病毒垂直傳播的特性，導(dǎo)致新生犢牛也存在IBRV抗體。反觀牛場(chǎng)DZ4，實(shí)行自繁自養(yǎng)，近3年中均未檢出IBRV抗體陽(yáng)性牛，說(shuō)明牛場(chǎng)的管理方式對(duì)于疫病的防控會(huì)起到關(guān)鍵作用。

2.犢牛與成年?？贵w關(guān)系的分析。對(duì)于自繁自養(yǎng)的牛場(chǎng)，如濟(jì)南市的3個(gè)牛場(chǎng)，牛場(chǎng)DZ5、DY2等，新生犢牛全部來(lái)源于牛場(chǎng)的懷孕牛，犢牛出生后需飼喂初乳，如果懷孕牛曾經(jīng)感染過(guò)IBRV，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，并隨著初乳被犢牛吸收。初乳在犢牛體內(nèi)的生物半衰期只有3周左右，但9月齡也能檢測(cè)到，同時(shí)考慮到IBRV垂直傳播的特性，體內(nèi)有IBRV抗體的懷孕牛產(chǎn)犢后的犢牛IBRV抗體檢測(cè)應(yīng)為陽(yáng)性。本研究采集的犢牛與成年牛樣品雖然只有部分為母子關(guān)系，但抗體陽(yáng)性率整體符合規(guī)律，即懷孕牛IBRV抗體陽(yáng)性牛產(chǎn)犢后犢牛IBRV抗體也為陽(yáng)性。而另外部分的牛場(chǎng)，由于經(jīng)常引進(jìn)、賣出犢牛，加之引進(jìn)的犢牛背景不清楚，部分犢牛育成后會(huì)配種產(chǎn)犢，導(dǎo)致犢牛與成年牛之間沒(méi)有明顯的IBRV抗體相關(guān)性。

四、結(jié)論

流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，山東省的牛場(chǎng)普遍感染IBRV，抗體陽(yáng)性率為5%～58%，不同牛場(chǎng)檢測(cè)結(jié)果差異較大，不同牛場(chǎng)犢牛、成年牛的抗體檢出率并無(wú)明顯相關(guān)性。