含水量對超低溫保存后馬尾松種子生理生化特性的影響

張曉寧，張 燁，肖玉菲，姚瑞玲，陳博雯，覃子海，劉海龍

(1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，南寧 530002；2.廣西優(yōu)良用材林資源培育重點實驗室，南寧 530002)

超低溫保存(cryopreservation)是指在不高于-100 ℃條件下保存生物材料，常用液氮(-196 ℃)作為冷源[1]；在此溫度下，能最大限度地抑制生理代謝活動，降低劣變頻率。超低溫保存是目前為止集簡便、實用、低成本、占地少于一體的一種長期保存種質(zhì)資源的方法[2]，在農(nóng)作物[3]、果蔬[4]、中藥材[5]及林木種子[6-7]方面都有研究。

馬尾松(PinusmassonianaLamb)從種子發(fā)芽到進入繁殖期時間間隔較長(實生植株約在第6年才進入正常的開花結(jié)實期)[8]，而常溫開放保存時間較短(3～4年幾乎全部喪失發(fā)芽力)，即便在2～4 ℃低溫密閉條件下也只能維持10年左右[9-10]。因此，開展超低溫保存研究對延長馬尾松保存期限具有現(xiàn)實和必要意義，除了資源安全外也為其種質(zhì)資源的交流、遺傳改良和良種推廣等生產(chǎn)實踐和科學(xué)研究提供了可靠的物質(zhì)保障[11]。

項目組前期對馬尾松種子進行了超低溫保存研究，結(jié)果表明，含水量是影響其凍存效果的關(guān)鍵影響因子，在含水量為6.1%時獲得高達91.33%的凍后發(fā)芽率[12]。超低溫保存不僅對種子生活力產(chǎn)生影響，還會對種子的生理生化特性產(chǎn)生影響[13]，許多研究通過測量材料生理生化特性判斷超低溫保存效果[14,15]。

本研究在此基礎(chǔ)上，對不同含水量馬尾松種子凍存后REC、MDA、抗氧化物酶、非酶抗氧化劑、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化進行了研究，旨在從生理角度揭示不同含水量下各生理指標的變化規(guī)律，闡述其損傷/保護的生理機制，為進一步提高馬尾松保存效果提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

成熟馬尾松(PinusmassonianaL.)種子于2016年11月采自廣西藤縣，千粒重為11.4 g，發(fā)芽率為90.25%，初始含水量為9.56%。利用浸種和硅膠干燥的方式獲取27.4%、22.7%、16.8%、10.7%、6.1%、4.8%、3.2%等7個含水量梯度的種子，不同含水量的種子凍存后發(fā)芽率見表1(見參文獻[12])。設(shè)對照組和試驗組，對照組直接測定生理指標，試驗組經(jīng)超低溫保存后測定其生理指標。

表1 不同含水量馬尾松種子凍存后發(fā)芽率

1.2 測定方法

相對電導(dǎo)率(REC)的測定參見任淑娟等[16]的方法；丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度采用硫代巴比妥酸(TBA)法測定；超氧化物歧化酶(SOD) 活性采用黃嘌呤氧化酶法測定，過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚比色法測定，過氧化氫酶(CAT)活性采用磷鉬酸法測定；AsA(Vc)含量采用菲咯啉比色法測定；可溶性糖、可溶性蛋白含量分別采用蒽酮法和考馬斯亮藍法測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office Excel(2016)軟件對試驗數(shù)據(jù)進行整理作圖，采用SPSS 19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析、多重比較、生理生化指標的相關(guān)性及主成分分析。試驗結(jié)果為3個重復(fù)的平均值±標準誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 MDA和種子浸出液REC的變化

如圖1， REC和MDA含量受含水量影響顯著，隨含水量增加，變化趨勢大體相同，均為先降后升，在含水量為6.1%時，REC和MDA含量最低，分別為15.33%和5.61 nmol·g-1，表明該含水量下質(zhì)膜電解質(zhì)外滲量少，脂質(zhì)過氧化程度低，受到的損傷小。與MDA不同的是，REC表現(xiàn)出一個較廣的適應(yīng)范圍，在含水量為4.8%～10.7%時，電導(dǎo)率值均較小，無顯著差異。

圖1 含水量對馬尾松種子冷凍保存后浸出液REC和MDA的影響

2.2 抗氧化物酶活性及非酶抗氧化劑含量的變化

不同含水量POD活性(圖2)變化呈升—降—升—降的雙峰型，在4.8%，6.1%和22.7%時最高，在10.7%時最低。CAT活性(圖2)隨含水量增加總體呈下降的趨勢，在含水量為3.2%～10.7%的范圍內(nèi)活性較高，同樣表現(xiàn)出一定程度的廣適性。當(dāng)含水量大于10.7%時，CAT 活性逐漸下降。SOD活性(圖3)總體呈先升后降的趨勢，在6.1%時達到最高值(577.92 U·g-1)，后逐漸下降，直至含水量為16.8%時，達到最低值(414.31 U·g-1)，含水量繼續(xù)增加，SOD活性小幅上升。AsA含量變化與POD類似，呈雙峰形狀，在含水量為6.1%和22.7%時含量較高，低于4.8%時含量較低。

圖2 含水量對馬尾松種子冷凍保存后POD,CAT活性的影響

圖3 超低溫保存對不同含水量馬尾松種子SOD活性，AsA含量的影響

2.3 可溶性糖(SS)和可溶性蛋白(SP)含量的變化

SS和SP含量變化如圖4所示，SS在含水量為4.8%～10.7%時較高，在含水量小于4.8%或大于10.7%時顯著降低。SP隨含水量升高波動性變化，含水量為4.8%～6.1%時，達最大值。

圖4 超低溫保存對不同含水量馬尾松種子SS和SP含量的影響

3 結(jié)論與討論

植物材料在超低溫保存過程中，易受到代謝脅迫、脫水脅迫、結(jié)冰傷害及由此帶來的機械損傷等，從而使其不同部位受到不同程度的損傷[17]。種子在低溫逆境時，最先受損傷的是細胞膜系統(tǒng)[18]。脫水、冷凍和降溫都可能會使細胞膜的脂質(zhì)層發(fā)生相變(由液晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài))，膜系統(tǒng)收縮，出現(xiàn)裂縫或通道，導(dǎo)致膜透性增加，細胞吸漲時，胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，溶液電導(dǎo)率(REC)升高，因此，REC與膜受損傷的程度呈正相關(guān)[17]。本研究中，REC在含水量為6.1%時，達最低值，表明在此含水量下膜通透性較小，細胞膜系統(tǒng)受到的損傷較輕[19]。含水量增加或減少時，REC均增加，含水量太高容易導(dǎo)致冷凍和化凍階段結(jié)冰使膜系統(tǒng)受到機械損傷，含水量太低在回復(fù)培養(yǎng)時會因快速復(fù)水產(chǎn)生吸漲傷害，太低的含水量也會降低種質(zhì)活性，最終影響超低溫保存效果[13,17]。

氧化傷害是超低溫保存過程中的次生傷害之一，逆境脅迫(包括低溫和脫水)會導(dǎo)致細胞內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生和積累，過量的ROS可使膜脂的不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化作用，最終生成MDA[20,21]， MDA對細胞有毒害作用，可降低SOD，POD等抗氧化物酶的活性，使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化[22]； SOD，POD，CAT及AsA是重要的保護酶和非酶保護劑，可將過量有毒的ROS轉(zhuǎn)化成無毒害的O2和H2O等物質(zhì)。在含水量為6.1%時，MDA含量最低，各種抗氧化物酶活性和非酶抗氧化劑含量均達到最大。表明在此含水量下抗氧化能力較強，自由基水平較低，細胞膜系統(tǒng)受到的損傷較輕[14,19]。POD活性在4.8%，6.1%和22.7%時達到最大，一方面體現(xiàn)了其保護效應(yīng)，高活力種子具有高的抗逆酶活性[23]。另一方面推測高含水量下POD參與ROS的產(chǎn)生，表現(xiàn)出對細胞的傷害效應(yīng)[24]。POD的傷害效應(yīng)在金絲李種子的研究中有報道，當(dāng)種子含水量超過10.7%時，金絲李種子POD活性迅速增加[25]。CAT活性隨含水量增加呈下降趨勢，這與珙桐離體胚軸結(jié)果一致，表明高含水量下冷凍材料受到了一定程度的損傷[26]。

植物的超低溫耐性受植物體內(nèi)保護性物質(zhì)影響。可溶性糖和可溶性蛋白作為重要的保護性物質(zhì)，可通過增加細胞液濃度，降低細胞滲透勢，提高細胞保水能力，降低細胞冰點，提高植物超低溫耐性[17,27]。本研究中，在含水量為6.1%時，可溶性糖和可溶性蛋白的含量均達到最大。宋紅等對玉嬋花的研究結(jié)果也表明，適當(dāng)降低含水量，可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)上升，有利于保持種子的低溫耐性，凍后發(fā)芽率顯著升高[15]。

值得指出的是，在本研究中許多生理指標的最優(yōu)值(統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異)都是一個相對較寬的含水量范圍，如REC值在含水量為4.8%～10.7%時較低；POD和CAT活性分別在含水量為4.8%～6.1%和3.2%～10.7%時較高；SS和SP含量分別在含水量為4.8%～10.7%和4.8%～6.1%時較高，這體現(xiàn)了正常型種子相對較廣的安全含水量范圍[12]。

本研究通過對生理指標的測量，進一步從生理層面證明6.1%左右的含水量為超低溫保存的最適含水量，揭示了影響超低溫保存效果的生理機制，即細胞膜透性小、膜脂過氧化程度低、細胞抗氧化能力強、胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度高，為進一步提高馬尾松種子超低溫保存效果，從分子層面解析超低溫保存機理提供了理論基礎(chǔ)。