黑龍江省部分有色稻種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析

徐麗麗，劉書(shū)涵，李世偉，康紹玲，王敬國(guó)，付俊生，韓 笑，孫 健

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

水稻是全球近半數(shù)人口的主要糧食作物。有色稻米是特種稻米的重要成員，由于其果皮和種皮內(nèi)堆積了大量色素，糙米可呈現(xiàn)綠、褐、紅、紅黑、烏黑、紫黑、黃等多種顏色[1,2]。有色稻米的營(yíng)養(yǎng)成分較白米更為豐富，不僅含有較多的蛋白質(zhì)和氨基酸，還含有比普通白米更多的維生素和礦質(zhì)元素[3,4]。研究表明，褐色稻米種皮富含鐵和鋅，棕色米的種皮中含有黃酮類(lèi)物質(zhì)，紅米的種皮中含原花青素較多，黑米的種皮富含花青素[5-7]，而上述物質(zhì)在普通白米中的含量均非常低。世界部分地區(qū)的人群由于貧困不能購(gòu)買(mǎi)富含多重營(yíng)養(yǎng)的食物而出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)缺乏癥，作為主食的稻米價(jià)格則相對(duì)低廉，大多數(shù)人都可以接受。早在1992年，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織與世界衛(wèi)生組織開(kāi)始對(duì)東南亞地區(qū)以水稻作為主食的人群的營(yíng)養(yǎng)缺乏癥加以關(guān)注，并且和多個(gè)組織合作開(kāi)展了包含有色米在內(nèi)的功能稻相關(guān)遺傳育種研究[5]。

SSR分子標(biāo)記又稱(chēng)微衛(wèi)星，因其簡(jiǎn)便快速、重復(fù)性高、可靠性強(qiáng)、穩(wěn)定性好且具有共顯性等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于水稻的多種研究領(lǐng)域，在遺傳多樣性分析和遺傳圖譜構(gòu)建分子標(biāo)記輔助選擇等方面都做出了貢獻(xiàn)。張曉麗等[8]利用72對(duì)SSR引物分析316份東南亞國(guó)家的水稻品種并得出了后期選配親本的依據(jù)；應(yīng)杰政等[9]利用24個(gè)SSR引物對(duì)63個(gè)常規(guī)主栽品種進(jìn)行分析，通過(guò)聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)了其品種明顯的地域分布特點(diǎn)；馬靜等[10]利用82對(duì)SSR引物分析59份寧夏水稻品種，發(fā)現(xiàn)寧夏水稻遺傳基礎(chǔ)狹窄，應(yīng)當(dāng)加大引進(jìn)新親本材料的力度；玄英實(shí)等[11]利用68對(duì)SSR引物對(duì)東北地區(qū)91份粳稻品種進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)東三省的粳稻遺傳基礎(chǔ)狹窄；孫健等[12]利用42對(duì)SSR引物分析80份黑龍江省主栽水稻品種，發(fā)現(xiàn)黑龍江省大部分水稻主栽品種遺傳背景相似，并對(duì)后續(xù)水稻育種提出展望。黑龍江省是中國(guó)水稻的重要產(chǎn)區(qū)，但針對(duì)有色稻米的研究較少。本研究對(duì)黑龍江省部分有色稻米種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期為黑龍江省有色稻資源的有效利用及育種的親本組配提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為41份黑龍江省部分有色稻種質(zhì)資源和1份云南有色秈稻資源雞血糯，共42份材料。材料的名稱(chēng)與糙米顏色詳見(jiàn)表1。

表1 供試的42份水稻種質(zhì)資源名稱(chēng)及其糙米顏色

1.2 方 法

1.2.1DNA提取

取42份水稻樣品3～4葉時(shí)期的葉片，用改進(jìn)的CTAB法[13]提取水稻基因組DNA。

1.2.2多態(tài)性引物的篩選

用供試的42份水稻樣品對(duì)500對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選，選出具有多態(tài)性的引物以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.3PCR擴(kuò)增及聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)

PCR擴(kuò)增過(guò)程選用10μL的反應(yīng)體系，成分包括：5μL 2×TaqMaster Mix(Dye)；Forward Primer 0.04μL；Reverse Primer 0.04μL；Template DNA 0.01μg；ddH2O 3.91μL。PCR反應(yīng)在eppendorf PCR儀器中進(jìn)行，程序?yàn)椋河?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)數(shù)為35，72 ℃延伸6 min后于4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物在6%的聚丙烯酰胺變性膠上電泳，銀染法檢測(cè)。

表2 供試42份有色稻米種植遺傳多樣性分析結(jié)果

1.2.4數(shù)據(jù)分析

SSR是共顯性分子標(biāo)記，對(duì)于同一對(duì)引物擴(kuò)增出的不同條帶可代表同一基因位點(diǎn)上不同的等位基因。分子標(biāo)記數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)整理之后使用PowerMarker V 3.25軟件[14]對(duì)每個(gè)SSR引物位點(diǎn)的主要等位基因頻率(Major Allele Frequency)、基因型(Genotype No)、等位基因(Allele No)、基因多樣性(Gene Diversity)以及多態(tài)性信息含量指數(shù)(PIC)進(jìn)行分析。使用NTSYSpc軟件[15]進(jìn)行聚類(lèi)分析，并計(jì)算供試材料之間的相似系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增片段多態(tài)性分析

共檢測(cè)到224個(gè)等位基因，平均每個(gè)標(biāo)記檢測(cè)到3.86個(gè)。主要等位基因頻率的變化范圍為0.523 8～0.976 2，在篩選出的58對(duì)SSR引物中，RM 131、RM 220、RM 223、RM 278、RM 315、RM 1261、RM 1271、RM 1300等40個(gè)引物的主要等位基因頻率較高，超過(guò)0.9；RM 24607的主要等位基因頻率最低，為0.523 8。對(duì)基因型數(shù)量的分析中除RM 488、RM 584、RM 11273為3外，其余引物的基因型數(shù)量均為2。RM 24607和RM 1379的基因多樣性最高，超過(guò)0.4，RM 131、RM 220、RM 223、RM 278、RM 315、RM 1261、RM 1271、RM 1300的基因多樣性則最低，為0.046 5。每個(gè)SSR位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性信息含量在0.045 4～0.374 4之間，其平均值為0.144 3。其中，以RM 24607的多態(tài)性信息含量指數(shù)最大，為0.374 4，而RM 131、RM 220、RM 223、RM 278、RM 315、RM 1261、RM 1271、RM 1300的多態(tài)性信息含量指數(shù)最低，為0.045 4。

圖1 供試42個(gè)有色稻米品種聚類(lèi)分析結(jié)果

2.2 聚類(lèi)分析

每對(duì)SSR引物檢測(cè)到的每條多態(tài)性帶視為1個(gè)等位基因，將電泳圖譜中清晰的條帶賦值為1，無(wú)帶時(shí)賦值為0，缺失時(shí)為2，將經(jīng)過(guò)整理的數(shù)據(jù)利用NTSYS-pc 2.10 e系統(tǒng)軟件進(jìn)行分析，UPGMA聚類(lèi)分析的結(jié)果詳見(jiàn)圖1。

供試的42份有色稻米品種遺傳相似系數(shù)在0.21處分為兩個(gè)大類(lèi)，第Ⅰ類(lèi)包含紅血糯、雞血糯、白珍珠稻、紫稻3號(hào)、黑稻、黑稻2、黑糯1號(hào)、黑甜1號(hào)、紅糯1號(hào)、綏紅香、綏098038、海K-9、163761-4、紅心米、紅殼、小黑稻、紫大粒、7366、早黑2、隆化大紅谷欠、大錦、花芒、香芒稻、西紅-2、暗紅米、一展紅-2、92533、AC-1、一展紅-1、6 B-7、B 137、黑稻-6、黑紫谷、長(zhǎng)芒矮、EB 139、PA 3-1、普優(yōu)黑珍珠、紅香一號(hào)、紅殼米、L-7共40個(gè)品種，第Ⅱ類(lèi)包含紅米一號(hào)和圓香黑共2個(gè)品種。

其中第Ⅰ類(lèi)可在遺傳相似系數(shù)0.53處再分為2個(gè)亞類(lèi)，第1亞類(lèi)包含紅血糯、雞血糯2個(gè)品種，第2亞類(lèi)包含白珍珠稻、紫稻3號(hào)、黑稻、黑稻2等共38個(gè)品種，在第1亞類(lèi)中紅血糯和雞血糯之間的遺傳相似系數(shù)在0.55～0.57之間。第2亞類(lèi)品種間遺傳相似系數(shù)普遍高于0.60，其中部分品種間的遺傳相似系數(shù)達(dá)到0.80以上，如黑糯1號(hào)與黑甜1號(hào)，西紅-2與香芒稻，一展紅-2與92533等。

第Ⅱ類(lèi)包括紅米一號(hào)和圓香黑2個(gè)品種，二者的遺傳相似系數(shù)未超過(guò)0.60。

3 討 論

隨著生活水平的不斷提高，生活需求愈發(fā)多樣化，人們更加追求稻米的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功效等特性，高營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的功能性水稻品種的培育日益受到重視。我國(guó)加入“WTO”后，農(nóng)產(chǎn)品市場(chǎng)不斷受到?jīng)_擊，追求稻米的高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和高功效亦是國(guó)際市場(chǎng)發(fā)展的重要方向[1]。而現(xiàn)階段我國(guó)仍存在優(yōu)質(zhì)品種的關(guān)鍵指標(biāo)優(yōu)而不全、品種結(jié)構(gòu)類(lèi)型亟待優(yōu)化配套，生產(chǎn)技術(shù)需加大研發(fā)和集成等問(wèn)題[6]。黑龍江省是水稻的重要產(chǎn)區(qū)，但對(duì)有色稻品種的研究仍相對(duì)較少，審定的有色稻品種難以滿足市場(chǎng)需要。且現(xiàn)階段有色稻米的適口性、加工性等有待改良[17]，仍需繼續(xù)加大資源創(chuàng)新力度。

參考1980年由Botstein等提出的衡量基因變異程度的多態(tài)性含量指標(biāo)：PIC>0.5則該基因座為高度多態(tài)基因座；0.25

黑龍江地區(qū)大部分育成品種以蝦夷和石狩白毛為共同祖先，遺傳基礎(chǔ)與其他地區(qū)相比仍然比較狹窄[8,9,23]，省內(nèi)各單位為加快育種進(jìn)程頻繁引種，致使優(yōu)良性狀的骨干親本被多次反復(fù)利用，且由于黑龍江省的地區(qū)氣候因素，種質(zhì)單一化程度愈發(fā)加劇[12]。水稻的品種遺傳多樣性低，可能導(dǎo)致水稻產(chǎn)量徘徊、品質(zhì)和抗性難取得重要突破等現(xiàn)象出現(xiàn)[9]，從而影響稻米品質(zhì)。應(yīng)杰政等研究發(fā)現(xiàn)，遺傳距離較遠(yuǎn)的材料間組配容易產(chǎn)生強(qiáng)雜種優(yōu)勢(shì)[9]，若某品種種內(nèi)的遺傳多樣性豐富，其基因變化也會(huì)豐富，該物種對(duì)環(huán)境改變的適應(yīng)性就越強(qiáng)，進(jìn)化的潛力就越大。反之適應(yīng)能力則弱，進(jìn)化潛力就相對(duì)較小[23,24]。本研究顯示，供試品種中黑龍江省41個(gè)有色稻米品種的遺傳多樣性豐富度相對(duì)較低[8,9,23]，進(jìn)化潛力相對(duì)較小。具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的有色稻的色素基因與落粒性基因、種子萌芽基因連鎖，在早年選育品種的過(guò)程中往往因其易落粒、種子萌芽率低而將有色米品種淘汰，有色稻的研究?jī)r(jià)值有待育種工作者發(fā)掘?？梢酝ㄟ^(guò)對(duì)有色稻的研究，進(jìn)一步完善水稻基因組的功能研究[25]。育種工作者仍需加大育種工作的力度，拓寬育種工作的思路。

在后續(xù)的育種工作中，應(yīng)避免或減少親緣關(guān)系過(guò)近的品種間雜交，可用親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的品種進(jìn)行雜交組配。調(diào)查顯示，在20世紀(jì)50年代到80年代的40多年間，整個(gè)北方稻區(qū)大面積推廣的212個(gè)早粳稻品種中，有97.2%的選育品種都和日本品種具有親緣關(guān)系[26]。故今后應(yīng)加大開(kāi)展在國(guó)內(nèi)外同緯度地區(qū)引種的力度，擴(kuò)大引種范圍，如加強(qiáng)與新疆、北美、歐洲等地進(jìn)行種質(zhì)資源的交流，從而減少骨干親本的重復(fù)利用，亦可通過(guò)生物強(qiáng)化的方式提高稻米中的B族維生素含量[3,7,27]。通過(guò)多種途徑有望選育出具備雜種超親優(yōu)勢(shì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，保健功能好，適口性好，便于食用加工的新有色稻米品種，讓有色稻米被大眾的接受程度更高，更廣泛地進(jìn)入日常生活，進(jìn)而平衡營(yíng)養(yǎng)攝入，改善飲食結(jié)構(gòu)，通過(guò)對(duì)主食調(diào)整達(dá)到全民養(yǎng)生保健。