影響多肉植物花粉活力及離體萌發(fā)率的因素研究

楊 瀾，彭 強，彭 婷，杜致輝，許紅娟，陳之林

(1.貴州省農(nóng)科院山茂園藝工程技術(shù)有限公司，貴陽 550006；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所，貴陽 550006； 3.貴州大學農(nóng)學院，貴陽 550025)

多肉植物(Succulents)是指根、莖、葉 3 種器官中任意1種具有發(fā)達的薄壁組織，用于儲存植物生長所需的水分和養(yǎng)分，外觀呈現(xiàn)出肥厚多漿的一類植物[1]。具有品種繁多、觀賞性佳、經(jīng)濟價值高等特點。全世界約有10 000多種多肉植物，常見的多肉植物主要是景天科(Crassulaceae)、百合科(Liliaceae)、仙人掌科(Cactaceae)和番杏科(Aizoaceae)。傳統(tǒng)的雜交育種是創(chuàng)制多肉植物新品種的主要手段?；ǚ凼沁M行雜交育種的主要載體，其活力受自身遺傳特性以及外界諸多因素的影響[2]?；ǚ勖劝l(fā)存在集體效應，一定區(qū)域內(nèi)的花粉數(shù)量越多萌發(fā)情況越好，當花粉數(shù)量達不到一定程度時便不能滿足正常萌發(fā)的要求，影響授粉受精過程的完成，挑選花粉數(shù)量多的品種進行授粉是順利完成授粉受精過程的首要條件[3]。自然條件下絕大多數(shù)多肉植物品種自花授粉不結(jié)實或結(jié)實率低，雜交后也會出現(xiàn)雜種胚敗育現(xiàn)象，雜交授粉工作在實際應用中存在一定的盲目性。因此對不同品種花粉活力高低的檢測和選擇合適的育種時期是雜交成功與否的關(guān)鍵，也是選擇父本材料的重要依據(jù)。本試驗擬通過對10種花粉量較大的景天科擬石蓮屬多肉植物進行花粉活力的檢測及花粉萌發(fā)率的研究，摸索不同散粉時期的花粉活力差異、花粉離體培養(yǎng)的最適宜溫度及適宜的觀察時間，以期對提高多肉植物育種效率提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

以種植于貴州省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所多肉種質(zhì)保育棚5年生的擬石蓮屬多肉植物品種花月夜(EcheveriapulidonisWalther)、靈隱 (擬石蓮屬雜交種)、烏木(EcheveriaagavoidesEbony Red)、羅密歐(EcheveriaagavoidesRomeo)、布蘭迪(Echeveriacoloratavar. Brandtii)、下弦月 (擬石蓮屬雜交種)、露娜蓮(Echeverialola)、藍絲絨(Echeveriasimulans)、黑爪(Echeveriamexensiszaragosa)、莎維娜(Echeveriashaviana)等10個品種為研究對象。

1.2 方 法

1.2.1不同散粉階段的花粉活力測定方法

通過2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)法染色快速測定不同散粉時期的花粉活力。TTC是一種氧化還原染料，能在呼吸酶的作用下著色，因此可根據(jù)著色情況來判斷花粉生活力。2019年3月，在晴天09：00—10：00時之間，采集4個散粉階段(第1階段：未散粉；第2階段：已散粉且柱頭無粘液；第3階段：已散粉且柱頭有粘液；第4階段：散粉后期柱頭粘液消失)的花粉或花藥，將采集的花粉挑入光片載玻片上，滴上現(xiàn)配制的TTC染液1～3滴，TTC染液的終濃度為0.5%，反復吸打混勻后放置于35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱暗光培養(yǎng)1 h。每個階段的材料均制作3個玻片，即3個重復。每個載玻片下選擇5個視野進行觀察，花粉總數(shù)大于100粒即可，計算每個視野有活力的花粉粒數(shù)占總花粉粒數(shù)的百分率，結(jié)果取平均值。

花粉活力(%)=(染色的花粉數(shù)/花粉?？倲?shù))×100%[4]。

1.2.2花粉的最佳培養(yǎng)條件和觀察時間的確定方法

在晴天09：00—10：00時之間，采集供試材料第3階段的花粉，用消過毒的鑷子將花粉輕輕剝落在滴有培養(yǎng)液的載玻片上，小槍頭反復吸打?qū)⒒ǚ哿＞鶆蛏㈤_，然后蓋上蓋玻片。將制好的玻片放入鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，分別放置于6個溫度梯度下(10、15、20、25、30、35 ℃)的恒溫培養(yǎng)箱中進行暗光培養(yǎng)9 h，每隔3 h用LEICA DM 2500顯微鏡觀察花粉萌發(fā)情況。每個處理均制作3個玻片，即3個重復。每個載玻片隨機選取3個視野(每個視野花粉不少于30粒)，統(tǒng)計每個視野花粉粒總數(shù)和萌發(fā)的花粉數(shù)，花粉萌發(fā)以花粉管長度大于花粉直徑為標準[5]。計算離體花粉萌發(fā)率，結(jié)果取平均值。

離體花粉萌發(fā)率(%)=(萌發(fā)的花粉數(shù)/花粉?？倲?shù))×100%。

試驗溶液均用蒸餾水配制，液體培養(yǎng)液為10%蔗糖+0.5%瓊脂[4]。

1.2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

用Excel軟件進行數(shù)據(jù)整理及繪圖，SAS 9.0軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同散粉時期的花粉活力檢測

采用TTC染色法，以10個供試品種的多肉植物為材料，比較不同散粉階段的花粉活力。染色結(jié)果表明：TTC染色法可以將10個供試品種的花粉染上色；不同散粉階段的花粉活力存在顯著性差異(p<0.05)；在花藥未散粉的第1階段花粉活力平均值為12.49%，剛散粉且柱頭無粘液的第2階段花粉活力平均值為15.07%，到散粉的第3階段，柱頭出現(xiàn)粘液時花粉活力平均值達到30.82%，花粉活力最強；隨著花序的開放和散粉階段的延續(xù)，散粉第4階段柱頭粘液消失后花粉活力平均值僅為15.05%。由圖1可知，花月夜花粉呈現(xiàn)球形，且大部分花粉粒均被染成紅色，表示這個階段的花粉活力強。

注：A為20倍物鏡下拍攝的圖片，B為10倍物鏡下拍攝的圖片。圖1 花月夜花粉散粉第3階段的活力檢測

表2 不同培養(yǎng)溫度下多肉植物的離體花粉萌發(fā)率

表1 TTC染色法檢測10個品種多肉植物不同散粉時期的花粉活力平均值

2.2 培養(yǎng)溫度對不同多肉植物品種離體花粉萌發(fā)率的影響

在不同溫度條件下離體培養(yǎng)一定時間后10個多肉品種離體花粉萌發(fā)率見表 2。離體培養(yǎng)結(jié)果顯示: 藍絲絨僅在20 ℃花粉萌發(fā)，其他溫度下萌發(fā)率極低；莎維娜在10 ℃低溫條件下無萌發(fā)；烏木在35 ℃高溫條件下無萌發(fā)；其它品種在6個培養(yǎng)溫度下花粉均有萌發(fā)；多數(shù)品種花粉離體培養(yǎng)最佳溫度為20 ℃，萌發(fā)率達到最大值，布蘭迪(25.14%)、黑爪(25.385%)、靈隱(20.74%)、露娜蓮(20.72%)、藍絲絨(21.7%)、羅密歐(28.743%)、烏木(17.86%)、下弦月(29.877%)；花月夜的試驗數(shù)據(jù)顯示花粉具有耐低溫的能力，在15 ℃低溫培養(yǎng)溫度下萌發(fā)率最高，為44.44%；而莎維娜的花粉具有耐高溫的能力，在30 ℃高溫培養(yǎng)下花粉萌發(fā)率最高，為22.653%。數(shù)據(jù)還顯示：4個多肉植物品種的花粉萌發(fā)率出現(xiàn)了2次峰值，呈現(xiàn)出先升高后降低再升高后降低的趨勢；其中布蘭迪(25.14%A、17.54%B)和羅密歐(28.743%A、18.517%B)的2次峰值分別出現(xiàn)在20 ℃和35 ℃，且2個峰值差異顯著；莎維娜(12.95%B、22.653%A)和下弦月(29.877%A、25.13%AB)在20 ℃和30 ℃培養(yǎng)溫度下出現(xiàn)峰值。

由表2還可見：培養(yǎng)溫度對品種布蘭迪、黑爪、羅密歐、莎維娜、烏木、下弦月離體花粉萌發(fā)率的影響差異極顯著(p<0.01)；對花月夜和藍絲絨的離體花粉萌發(fā)率影響表現(xiàn)為顯著(p<0.05)；然而，靈隱和露娜蓮在6個培養(yǎng)溫度下的花粉萌發(fā)率差異不顯著(p>0.05)。

注：A是在10倍物鏡下拍攝的圖片，B是在4倍物鏡下拍攝的圖片。圖2 25 ℃培養(yǎng)3 h觀察到布蘭迪在培養(yǎng)基上離體萌發(fā)

2.3 不同品種花粉離體萌發(fā)的適宜觀察時間

不同品種花粉萌發(fā)適宜的觀察時間存在較大差異。供試品種布蘭迪、花月夜、羅密歐、莎維娜、烏木、下弦月的花粉離體萌發(fā)適宜觀察時間為3 h，萌發(fā)率分別為17.468%、22.222%、18.89%、12.007%、8.322%、24.870%，隨著觀察時間的延長各品種的花粉萌發(fā)率均不斷下降。品種黑爪、靈隱、露娜蓮、藍絲絨的花粉離體萌發(fā)適宜的觀察時間為9 h，離體花粉萌發(fā)率分別為28.02%、16.883%、8.462%、8.147%。

2.4 多肉植物花粉活力檢測方法比較

雙因素顯著性分析(表3)發(fā)現(xiàn)：在離體培養(yǎng)法中，培養(yǎng)溫度是影響10種多肉植物離體花粉萌發(fā)率的極顯著因素(p<0.000 1)。如表4所示：花月夜的花粉在15 ℃低溫下培養(yǎng)3 h離體花粉萌發(fā)率為66.67%；靈隱的花粉在15 ℃低溫下培養(yǎng)9 h，萌發(fā)率達到29.51%；烏木、羅密歐、布蘭迪在20 ℃溫度下培養(yǎng)3 h的離體花粉萌發(fā)率分別為23.33%、35.56%、28.89%；下弦月、露娜蓮花粉在20 ℃培養(yǎng)6 h，萌發(fā)率值為32.17%和34.12%；藍絲絨和黑爪花粉在20 ℃下培養(yǎng)至9 h萌發(fā)率達到38.89%、48.91%。莎維娜的花粉在30 ℃高溫條件下培養(yǎng)6 h后離體花粉萌發(fā)率為26.67%。

離體花粉培養(yǎng)法中以最適條件獲得的不同品種離體花粉萌發(fā)率與TTC染色法檢測10種多肉植物第3階段的花粉活力值進行雙因素顯著性分析。表3數(shù)據(jù)顯示：品種間離體花粉萌發(fā)率差異顯著 (p=0.018 6)；而2種方法獲得的花粉活力值差異不顯著(p=0.219 2)。說明TTC染色法可作為快速檢測多肉植花粉活力的方法，對指導多肉植物的雜交育種工作有重要的實際意義。圖2中品種布蘭迪在液體培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)3 h可見花粉離體萌發(fā)。

表3 不同變量因素的差異顯著性分析

表4 離體花粉培養(yǎng)法和TTC染色法檢測花粉活力

3 討論與結(jié)論

3.1多肉植物的花粉活力是雜交育種的關(guān)鍵因素之一。品種、散粉時期、溫度均是影響多肉植物花粉萌發(fā)的重要因素。本試驗研究結(jié)果表明：多肉植物花粉活力在不同散粉階段存在顯著差異，這與在白玉蘭[6]、非洲菊[7]上的研究結(jié)果相似。多肉植物散粉的第3階段柱頭出現(xiàn)粘液時花粉活力最強，平均值達到30.08%(表1)。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，此時的花粉呈現(xiàn)出圓球形，花粉粒被染成紅色。推測多肉植物花粉活力與其成熟度有關(guān)，這與秦萌[8]在紫薇花中的研究結(jié)論相同，紫薇花盛花期的離體花粉萌發(fā)率>初開期>蕾期。

3.2差異顯著性分析發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)溫度是影響多肉植物離體花粉萌發(fā)率的極顯著因素(表3)。大多數(shù)品種雖然在10 ℃的低溫下也能萌發(fā)，但萌發(fā)率很低，極大的影響多肉植物的授粉結(jié)實率。因此，適宜的培養(yǎng)溫度是提高花粉萌發(fā)率的重要因素。不同物種花粉最佳離體萌發(fā)溫度差異很大?；в蠡ǚ垭x體培養(yǎng)的最適培養(yǎng)溫度為28 ℃[9]；黃刺玫[10]、望春玉蘭、 長花玉蘭、丹馨玉蘭、黃山木蘭花粉萌發(fā)最佳培養(yǎng)溫度均為25 ℃，溫度過高會抑制花粉萌發(fā)[11]。本試驗中，20 ℃是大多數(shù)供試品種花粉萌發(fā)的最適宜溫度，離體花粉萌發(fā)率達到最大峰值。布蘭迪28.89%、黑爪48.91%、露娜蓮34.12%、藍絲絨38.89%、羅密歐35.56%、烏木23.33%、下弦月32.17%?；ㄔ乱埂㈧`隱的花粉在較低的溫度下活力高，本試驗中的最適萌發(fā)溫度為15 ℃，萌發(fā)率分別達到66.67%、29.51%。而莎維娜的花粉具有耐高溫的能力，在30 ℃高溫培養(yǎng)下花粉萌發(fā)率最高，為26.67%(表4)。4個多肉植物品種(布蘭迪、羅密歐、莎維娜、下弦月)的花粉萌發(fā)率在6個溫度梯度下呈現(xiàn)出先升高后降低再升高后降低的趨勢，先后出2次峰值。其中品種布蘭迪(20 ℃/25.14%A、35 ℃/17.54%B)、羅密歐(20 ℃/28.743%A、35 ℃/18.517%B)、莎維娜(20 ℃/12.95%B、30 ℃/22.653%A)的2個峰值差異顯著(表2)，這可能與品種特性有關(guān)，需要進一步深入研究。

3.3花粉完成其生理生化過程需在一定的培養(yǎng)時間范圍內(nèi)，不同種類的植物花粉萌發(fā)所需的時間差異較大?；в蠡ǚ垭x體培養(yǎng)最適觀察時間僅為4 h[9]，楸樹花粉萌發(fā)的適宜培養(yǎng)時間則為6 h[12]，杜仲花粉的培養(yǎng)時間應達到18 h[13]，果梅花粉的最佳培養(yǎng)時間為24 h[14]。香椿花粉生活力的最佳離體培養(yǎng)時間為30 h[15]。本試驗中，不同品種的花粉離體萌發(fā)的適宜觀察時間存在較大差異。由表4可知：花月夜、烏木、羅密歐、布蘭迪的花粉萌發(fā)觀察時間以3 h較好；下弦月、露娜蓮、莎維娜花粉萌發(fā)的適宜觀察時間為6 h；靈隱、藍絲絨、黑爪則需要培養(yǎng)至9 h進行觀察。與離體萌發(fā)法不同的是TTC染色法具有操作簡單，需時短的優(yōu)點，在實際育種過程中TTC染色法常被用于玉米[16]、大豆[17]、萱草[18]等植物的花粉活力快速檢測。本試驗2種方法分別在最佳條件下測得的花粉活力差異不顯著(p=0.219 2)，這與林開勤等[19]在茶樹花粉活力測定方法研究上的結(jié)果一致。TTC染色法更有利于快速檢測多肉植物的花粉活力。