除草劑Basta對番茄再生體系的影響

岳寧波　潘鵬程　潘寅濤　閆見敏　李云洲

除草劑Basta對番茄再生體系的影響

岳寧波潘鵬程潘寅濤閆見敏李云洲

（貴州大學農(nóng)學院貴州貴陽550025）

以番茄()‘GZ01’材料下胚軸為外植體，探究不同濃度Basta處理對番茄愈傷組織誘導(dǎo)、分化以及幼苗的影響，以期為以Bar基因作為選擇標記基因的番茄轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明：番茄對Basta有一定的天然本底抗性，同時，Basta對番茄愈傷組織的生長分化及葉綠素的合成具有一定的抑制作用，當Basta處理濃度小于0.5 mg·L-1時，番茄愈傷組織可以生長分化，當Basta處理濃度大于1.0 mg·L-1時，番茄愈傷組織培養(yǎng)后期死亡。當選擇壓濃度為1.0 mg·L-1，最宜作為番茄遺傳轉(zhuǎn)化的標記基因。

番茄；選擇壓；Basta

中國是番茄種植面積最廣的國家[1]，但我國每公頃番茄產(chǎn)量與其他番茄生產(chǎn)國相比卻較低，造成產(chǎn)量低的主要原因是雜草降低了作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，同時增加了生產(chǎn)成本[2]。通過化學藥劑除草是目前番茄生產(chǎn)中最常用的除草方式[3]，然而，殺草普廣、活性高的除草劑大多缺乏選擇性，在殺滅雜草的同時對作物也會產(chǎn)生藥害[4]。培育具有除草劑抗性的作物，在降低生產(chǎn)成本的同時也提高了作物的安全性[5]。

Basta是一種廣譜非選擇性的除草劑，其有效成分是L-phosphiothricin（PPT）的銨鹽，對植物的地上部和地下部分均有枯死作用。研究證明，轉(zhuǎn)基因的植物能表現(xiàn)出對除草劑Basta的抗性[6]，由于栽培的番茄在苗期通常需要人工除草，因此，表達抗除草劑的轉(zhuǎn)基因番茄可以大幅度的降低人工成本。

再生體系的優(yōu)化是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化番茄成功的關(guān)鍵[7]，而將基因作為選擇標記基因，將其應(yīng)用于番茄轉(zhuǎn)基因研究中，不僅可以起到篩選轉(zhuǎn)化子的作用，而且獲得的轉(zhuǎn)基因植株還具有抗除草劑的特殊功能。目前將基因作為選擇標記基因應(yīng)用于番茄基因工程中研究甚少，作為篩選抗性壓的Basta選擇壓也不知，該實驗研究了不同濃度Basta對番茄愈傷組織生長和分化的影響，并據(jù)此選擇合適的轉(zhuǎn)基因篩選壓，為以基因為選擇標記基因的番茄轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供前提和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料和試劑

番茄材料“GZ01”由貴州大學農(nóng)學院植物病理實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌苗的獲得

精選健康的番茄種子用1.0 %的NaClO消毒5 min后，用無菌水沖洗3~5次，30 s/次，用滅菌的濾紙吸干后接種于1/2MS培養(yǎng)基于黑暗中培養(yǎng)，待種子發(fā)芽露白后置于光照強度240 mol·m-2·s-1的人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（光/暗：16 h/8 h，溫度：28 ℃/18 ℃（光/暗），相對濕度70 %）[1]。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)及分化

選取生長10 d的無菌苗，將其子葉切割成0.5 cm2正方形小塊置于誘愈培養(yǎng)基（MS+3.0mg·L-1 6-BA +0.1 mg·L-1 IAA）上進行培養(yǎng)，葉背朝下，光照培養(yǎng)，每10 d進行一次繼代培養(yǎng)，待長出愈傷后，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基（MS+2.0mg·L-16-BA +0.2 mg·L-1IAA）上繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 Basta處理

Basta對愈傷組織的生長影響：將GZ01 番茄4-5mm大小的胚性愈傷組織接種在附加0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg·L-1Basta的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，稱其重，培養(yǎng)4周后，觀察其生長情況，再稱其重，計算其在不同Basta濃度下增重率，每一濃度3此重復(fù)，取平均值。增重率（％）=（末重-初重）∕初重×100.0 %

Basta對番茄幼苗的影響：使用0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg·L-1的Basta處理5葉期番茄幼苗一周后，檢測葉綠素a和葉綠素b的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 Basta對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由圖1可知，Basta對番茄愈傷組織的誘導(dǎo)有抑制作用，當所用的Basta濃度大于1 mg·L-1時，番茄愈傷組織全部變?yōu)楹稚⑶宜劳觥６鴮φ丈L正常、膨大，外植體保持綠色，愈傷組織增重率為833.0 %。處理中Basta濃度為0.5 mg·L-1、1 mg·L-1時，外植體部分死亡，部分仍然保持綠色，隨著Basta濃度的增加，愈傷組織的增重率從883.0 %逐漸下降到99.3 %（見圖1）。

圖1　不同Basta濃度對番茄愈傷組織生長的影響

2.2 Basta對番茄幼苗的影響

由圖2可知，Basta對葉綠素a和葉綠素b的合成有一定的抑制作用，隨著Baste濃度的增加，葉片葉綠素a和葉綠素b都隨著降低，當Baste濃度大于2.5 mg·L-1，與對照達到顯著差異，抑制效果顯著。

圖2　不同濃度的Basta對葉綠素的影響

3 討論與結(jié)論

轉(zhuǎn)基因技術(shù)通常會涉及報告基因（也稱標記基因），通過報告基因指示目的基因是否成功轉(zhuǎn)入受體細胞。常用的報告基因有卡娜抗性基因（）[8]、潮霉素抗性基因（）[9]等。

該試驗通過篩選出番茄愈傷組織的最佳Basta選擇濃度，為番茄轉(zhuǎn)基因功能驗證提供研究基礎(chǔ)，同時也為篩選耐除草劑突變體提供研究基礎(chǔ)。該研究在實驗過程中還發(fā)現(xiàn)Basta對不定芽生根有一定抑制作用，使得以Basta為選擇壓的轉(zhuǎn)基因篩選變得困難，在該實驗中發(fā)現(xiàn)可以將不定芽先在添加Basta的生根培養(yǎng)基上篩選10 d左右，然后再轉(zhuǎn)接到不含Basta的生根培養(yǎng)基。這樣，陰性轉(zhuǎn)化子在前期篩選過程中死亡，陽性轉(zhuǎn)化子繼續(xù)存活，后期將存活的陽性轉(zhuǎn)化子介入不含Basta的生根培養(yǎng)基中生根。因此，分2個階段生根培養(yǎng)有助于陽性轉(zhuǎn)化子的獲得。并且通過實驗知道Basta抑制番茄幼苗的葉綠素a和葉綠素b的合成，可以通過對番茄幼苗噴施2.5 mg·L-1Basta再次篩選耐除草劑突變體。

另外，除草劑的大規(guī)模使用，節(jié)約了大量勞動力的同時，也給土壤造成一定污染，盡管一些除草劑可以降解，但是完全降解也需要一定年限，當今土地資源極度短缺，提高土地復(fù)種指數(shù)是解決土地資源短缺的主要措施，而除草劑的殘留對下一輪作物生長有一定影響。尤其在蔬菜生產(chǎn)中，除草劑殘留對下一茬蔬菜生長影響很大。因此，在今后的研究中應(yīng)該進一步研究田間除草劑殘留對下一茬番茄生長產(chǎn)生的影響。

[1]Anonymous. FAOSTAT[EB/OL].www. faostat.fao.org.

[2]Bakht T,Khan I A. WEED CONTROL IN TOMATOMill.) THROUGH MULCHING AND HERBICIDES[J].Pakistan Journal Of Botany,2014,46(1):290-293.

[3]Mayerová M, Madaras M,Soukup J. Effect of chemical weed control on crop yields in different crop rotations in along-term field trial[J].Crop Protection,2018(114):215-222.

[4]賈小霞,劉石,齊恩芳,等.草銨膦對轉(zhuǎn)基因抗草銨膦馬鈴薯田間雜草的防效及安全性評價[J].核農(nóng)學報,2019,33(10):2040-2047

[5]邱龍,馬崇烈,劉博林.耐除草劑轉(zhuǎn)基因作物研究現(xiàn)狀及發(fā)展前景[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2012,45(12):2357-2363.

[6]Lutz K A, Knapp J E, Maliga P,. Expression of bar in the plastid genome confers herbicide resistance[J].Plant physiology,2001,125(4):1585-1590.

[7]賀璽強,徐恒戩,趙汝鳳.不同品種類型番茄的離體再生體系研究[J].種子,2013,32(6):11-15.

[8]Rashid A.Comparison of a kanamycin versus hygromycin resistance gene in transgenic plant selection of Arabidopsis thaliana L[J].Tissue cell,2017,1(1):1-2.

[9]Chaudhry Z,Rashid H.An improved Agrobacterium mediated transformation in tomato using hygromycin as a selective agent[J].AFRICAN JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY,2010,9(13):1882-1891.

貴州省科技計劃項目(NO:黔科合平臺人才[2017]5788- 28)；貴州大學人才引進科研項目(NO:貴大人基合字[2017]50號)；貴州大學實驗室開放項目(NO:SYSKF2019- 55)

岳寧波(1996- )，女，貴州畢節(jié)人，碩士研究生，研究方向：蔬菜抗病育種。

閆見敏(1983- )，女，河北邯鄲人，博士，副教授，研究方向：蔬菜分子植物育種；李云洲(1986- )，男，山西晉城人，博士，講師，研究方向：蔬菜抗病育種。

S436.412

A

2095-1205(2020)05-14-02

10.3969/j.issn.2095-1205.2020.05.07