人工接種副干酪乳桿菌生產(chǎn)L-乳酸酸菜條件的研究

劉曉輝，陳順，李楊，敖靜，高曉梅，孫玉祿

(遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧 朝陽(yáng) 122000)

酸菜是我國(guó)北方的傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜制品，采用當(dāng)?shù)卮蟀撞税l(fā)酵而成，其清爽可口、鮮香嫩脆、解膩開(kāi)胃的品質(zhì)吸引著國(guó)內(nèi)外廣大的消費(fèi)者[1,2]。但普通酸菜中的乳酸基本是D-乳酸。由于人體只有代謝 L-乳酸的L-乳酸脫氫酶[3]，D-乳酸在體內(nèi)積累能引起代謝紊亂甚至導(dǎo)致中毒,對(duì)人體有害。世界衛(wèi)生組織(WHO)提倡在食品及醫(yī)藥行業(yè)中使用 L-乳酸取代D-乳酸，還明確規(guī)定，人體每天攝取D-乳酸的量限制在100 mg/kg體重以下。副干酪乳桿菌是一種益生菌[4]，不但可以產(chǎn)生L-乳酸，而且能夠耐受有機(jī)體的防御機(jī)制，如口腔中的酶、胃液中胃酸和小腸的膽汁酸等。副干酪乳桿菌進(jìn)入人體后可以在腸道內(nèi)大量存活，調(diào)節(jié)腸內(nèi)菌群平衡，促進(jìn)人體消化吸收。同時(shí)，副干酪乳桿菌對(duì)其宿主營(yíng)養(yǎng)、免疫、防病等具有顯著的益生功效?；谝陨显?，本試驗(yàn)采用可以產(chǎn)L-乳酸的副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)作為生產(chǎn)菌種，通過(guò)本試驗(yàn)研究出最佳生產(chǎn)條件，為L(zhǎng)-乳酸酸菜的工廠化生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ)。由于純種發(fā)酵的L-乳酸酸菜亞硝酸鹽濃度一直很低，所以此試驗(yàn)沒(méi)有將亞硝酸鹽含量作為檢測(cè)指標(biāo)[5-9]，只將乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量和Vc含量作為檢測(cè)指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

白菜：購(gòu)于超市。

1.1.2 試劑

檸檬酸銨、乙酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳、磷酸氫二鉀、亞鐵氰化鉀、乙酸、鹽酸萘乙二胺、硼砂、對(duì)氨基苯磺酸、濃鹽酸、乙酸鋅(均為分析純)：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；D/L-乳酸檢測(cè)試劑盒：愛(ài)爾蘭Megazyme公司，購(gòu)于賽恩斯(北京)儀器有限公司。

1.1.3 儀器

SHP-150恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏設(shè)備有限公司；SX-500型全自動(dòng)高溫高壓滅菌鍋 TDMY KOGYO公司；722S分光光度計(jì) 上海精密儀器儀表有限公司；SA-900-1JZ超凈工作臺(tái) 上海一恒科技有限公司；JA2103N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；小號(hào)缸；各種玻璃儀器等。

1.1.4 菌種

乳酸菌菌種：副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)本實(shí)驗(yàn)室冰箱4 ℃保藏。

1.1.5 培養(yǎng)基配制

MRS培養(yǎng)基：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，葡萄糖10 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸三銨2 g，吐溫80 1 g，K2HPO42 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·4H2O 0.05 g，水1000 mL，pH自然。分裝到500 mL三角瓶中，121 ℃高壓滅菌15 min，備用。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

將冰箱4 ℃保藏的菌種接入上述培養(yǎng)基中，放置培養(yǎng)箱中32 ℃培養(yǎng)24 h，傳種2代，鏡檢無(wú)雜菌備用。

1.2.2 酸菜中Vc含量檢測(cè)[10-12]

采用GB 5009.86-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中抗壞血酸的測(cè)定》中的2,6-二氯靛酚滴定法。

1.2.2.1 樣品處理

稱取切碎的酸菜樣品20.00 g，放在研缽中加2%草酸溶液少許研碎，倒入200 mL容量瓶中，加2%草酸溶液至刻度，用離心機(jī)離心沉淀后過(guò)濾備用。

1.2.2.2 樣品測(cè)定

吸取10.0 mL濾液于燒杯中，用2,6-二氯靛酚鈉鹽溶液滴定至桃紅色20 s不褪色，記下染料的用量。吸取2%草酸溶液，用染料作空白滴定記下用量。

1.2.2.3 結(jié)果計(jì)算

按照GB 5009.86-2016的計(jì)算公式。

1.2.3 L-乳酸含量檢測(cè)[13,14]

按照D/L-乳酸檢測(cè)試劑盒執(zhí)行。

表1 L-乳酸檢測(cè)步驟Table 1 The detection procedure of L-lactic acid

1.2.3.1 樣品處理

酸菜汁離心，必要時(shí)進(jìn)行稀釋，使L-乳酸濃度到0.003～0.30 g/L之間；溫育到25 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 樣品測(cè)定

按照表1步驟檢測(cè)。

1.2.3.3 結(jié)果計(jì)算

式中：C為L(zhǎng)-乳酸濃度(g/L)，V為最終體積(mL)，MW為L(zhǎng)-乳酸的分子量(g/mol)，ε為NADH在340 nm處的消光系數(shù)=6300(1/mol×cm)，d為光路(cm)，v為樣品體積(mL)。

如果樣品在制備階段已經(jīng)稀釋，結(jié)果必須乘以稀釋系數(shù)F。

1.2.4 乳酸菌計(jì)數(shù)[15,16]

按照GB 4789.35—2016執(zhí)行。

1.2.5 發(fā)酵條件[17,18]

1.2.5.1 不同發(fā)酵溫度對(duì)酸菜中Vc含量和酸菜汁中乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量的影響

將白菜除爛葉后，用清水沖洗，將白菜擺放在缸中，每缸放10 kg,壓實(shí)，加2%溫度為40 ℃的鹽水剛好超過(guò)白菜，加入5%液體副干酪乳桿菌菌種，封口，分別在25，28，32，35，37，39 ℃發(fā)酵12 d，檢測(cè)乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量和Vc含量。

1.2.5.2 不同食鹽濃度對(duì)酸菜中Vc含量和酸菜汁中乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量的影響

將白菜除爛葉后，用清水沖洗，將白菜擺放在缸中，每缸放10 kg,壓實(shí)，分別加1%、2%、4%、6%、8%、10%溫度為40 ℃的鹽水剛好超過(guò)白菜，加入5%液體副干酪乳桿菌菌種，封口，32 ℃發(fā)酵12 d，檢測(cè)乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量和Vc含量。

1.2.5.3 不同接菌量對(duì)酸菜中Vc含量和酸菜汁中乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量的影響

將白菜除爛葉后，用清水沖洗，將白菜擺放在缸中，每缸放10 kg,壓實(shí)，加2%溫度為40 ℃的鹽水剛好超過(guò)白菜，分別加入1%、3%、5%、7%、9%的液體副干酪乳桿菌菌種，封口，32 ℃發(fā)酵12 d，檢測(cè)乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量和Vc含量。

1.2.5.4 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸菜中Vc含量和酸菜汁中乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量的影響

將白菜除爛葉后，用清水沖洗，將白菜擺放在缸中，每缸放10 kg,壓實(shí)，加2%溫度為40 ℃的鹽水剛好超過(guò)白菜，加入5%的液體副干酪乳桿菌菌種，,封口，32 ℃發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為3，6，9，12，15 d。在蔬菜汁pH值達(dá)到3.5時(shí)檢測(cè)乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量和Vc含量。

1.2.5.5 不同初始水溫對(duì)酸菜中Vc含量和酸菜汁中乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量的影響

將白菜除爛葉后，用清水沖洗，將白菜擺放在缸中，每缸放10 kg,壓實(shí)，加2%溫度為55，50，45，40，35，30，25 ℃和自來(lái)水的鹽水剛好超過(guò)白菜，加入5%的液體副干酪乳桿菌菌種，封口，32 ℃發(fā)酵12 d，檢測(cè)乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量和Vc含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵溫度對(duì)酸菜中Vc含量和酸菜汁中乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量的影響

圖1 溫度對(duì)Vc和L-乳酸的影響Fig.1 The effect of temperature on Vc and L-lactic acid

由圖1可知，發(fā)酵溫度為32 ℃時(shí)乳酸菌菌數(shù)和L-乳酸含量最高，隨發(fā)酵溫度升高，乳酸菌菌數(shù)和L-乳酸含量都有所下降，這是因?yàn)闇囟冗^(guò)高不適應(yīng)此副干酪乳桿菌生長(zhǎng)，同時(shí)影響L-乳酸的產(chǎn)量。隨發(fā)酵溫度升高，Vc含量減少，這與Vc不耐高溫有關(guān)，在32 ℃時(shí)Vc含量降低相對(duì)少，故確定酸菜最佳發(fā)酵溫度為32 ℃。

2.2 不同食鹽濃度對(duì)酸菜中Vc含量和酸菜汁中乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量的影響[19]

圖2 食鹽濃度對(duì)Vc和L-乳酸的影響Fig.2 The effect of salt content on Vc and L-lactic acid

由圖2可知，食鹽濃度為4%時(shí)乳酸菌菌數(shù)和L-乳酸含量最高，但此時(shí)Vc含量相對(duì)低，在食鹽濃度為2%時(shí)Vc含量相對(duì)高，乳酸菌菌數(shù)和L-乳酸含量與食鹽濃度為4%時(shí)相差不大，再加之提倡低鹽健康飲食，最佳酸菜發(fā)酵食鹽濃度選擇2%。由圖2還可知，食鹽濃度過(guò)高，L-乳酸含量隨之降低，是因?yàn)檫^(guò)高的食鹽抑制了乳酸菌的生長(zhǎng)，從而降低了L-乳酸含量，食鹽濃度高也會(huì)加快Vc含量降低。

2.3 不同接菌量對(duì)酸菜中Vc含量和酸菜汁中乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量的影響[20]

圖3 接菌量對(duì)Vc和L-乳酸的影響Fig.3 The effect of inoculation amount on Vc and L-lactic acid

由圖3可知，在接菌量為5%時(shí)乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸和Vc含量均為最高，接菌量為1%和3%時(shí)、由于接菌量低發(fā)酵較慢，乳酸菌菌數(shù)和L-乳酸含量低，L-乳酸對(duì)Vc有一定的保護(hù)作用，在低濃度的L-乳酸環(huán)境中Vc含量下降快，接菌量為7%和9%時(shí)，由于接菌量過(guò)大、營(yíng)養(yǎng)缺乏抑制了乳酸菌生長(zhǎng)繁殖，乳酸菌菌數(shù)和L-乳酸含量較低，缺少L-乳酸的保護(hù)、Vc含量也有所下降，由此確定酸菜最佳接菌量為5%。

2.4 不同起始水溫對(duì)酸菜中Vc含量和酸菜汁中乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量的影響

圖4 起始水溫對(duì)Vc和L-乳酸的影響Fig.4 The effect of initial water temperature on Vc and L-lactic acid

由圖4可知，不同起始水溫對(duì)乳酸菌菌數(shù)和L-乳酸的產(chǎn)生速度有較大影響，初始水溫太高，菌種受到抑制使菌數(shù)少，產(chǎn)酸慢，當(dāng)初始水溫在45 ℃的乳酸菌菌數(shù)最高，產(chǎn)酸最快，這是因?yàn)?5 ℃的水加入白菜中，整體溫度在32 ℃左右，最適合此菌種發(fā)酵，隨著初始水溫的降低，發(fā)酵速度隨之降低，菌數(shù)和L-乳酸含量也會(huì)減少。初始水溫高會(huì)大大降低Vc含量，隨著初始水溫降低，Vc含量降低速度減慢。初始水溫45 ℃時(shí)菌數(shù)和L-乳酸含量高，但Vc含量低，在初始水溫40 ℃時(shí)的菌數(shù)和L-乳酸含量與初始水溫45 ℃的含量差別不大，這時(shí)Vc含量降低較少，所以初始水溫選擇40 ℃。

2.5 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸菜中Vc含量和酸菜汁中乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量的影響

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)Vc和L-乳酸的影響Fig.5 The effect of fermentation time on Vc and L-lactic acid

由圖5可知，酸菜最佳發(fā)酵時(shí)間為12 d，在發(fā)酵第12天時(shí)乳酸菌菌數(shù)和L-乳酸含量最高，L-乳酸含量達(dá)到最高值31.35 mg/kg，隨時(shí)間增加，L-乳酸含量變化不大，這是由于達(dá)到一定酸度對(duì)乳酸菌有一定抑制作用，基本停止發(fā)酵，L-乳酸含量不變，又因?yàn)樗岫冗^(guò)強(qiáng)殺死少量乳酸菌，乳酸菌菌數(shù)略有下降。由圖5還可知，Vc含量隨發(fā)酵時(shí)間增加而降低，在第12天時(shí)Vc含量為16.58 mg/100 g，相對(duì)原料白菜Vc含量為19.24 mg/100 g下降不大，故確定酸菜最佳發(fā)酵時(shí)間為12 d。

3 結(jié)論

人工接種副干酪乳桿菌發(fā)酵酸菜試驗(yàn)表明最適發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度32 ℃、食鹽濃度2%、接種量5%、初始水溫40 ℃、發(fā)酵時(shí)間12 d，在該條件下成品酸菜中乳酸菌菌數(shù)對(duì)數(shù)值為12 CFU/mL,L-乳酸含量為31.35 mg/kg，Vc含量為16.58 mg/100 g。