通絡(luò)生骨膠囊對(duì)軟骨氧化損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制探討

林惠湦，李譯，陳妮，魏軍漁

(1.浙江海正藥業(yè)股份有限公司，浙江 臺(tái)州 318000；2.寧波市第六醫(yī)院，浙江 寧波 315040)

骨關(guān)節(jié)炎(OA)又被稱為退行性骨關(guān)節(jié)炎，是易高發(fā)于中老年群體中的一種退行性病變,主要以關(guān)節(jié)軟骨的退化損傷，關(guān)節(jié)腔中炎癥因子高表達(dá)，關(guān)節(jié)邊緣部位和軟骨下骨反應(yīng)性增生作為主要的病理特征，具有一定程度的致殘性[1]。關(guān)節(jié)軟骨的損傷是OA的標(biāo)志性特征，OA具體的發(fā)病機(jī)制研究目前尚不明確，但軟骨細(xì)胞的活率、炎癥的嚴(yán)重程度、氧化損傷和軟骨的纖維化程度均與疾病的發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)。通過(guò)促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，抑制過(guò)度氧化應(yīng)激對(duì)軟骨細(xì)胞的損傷，降低炎癥因子的表達(dá)及其對(duì)下游信號(hào)通路的作用均是骨關(guān)節(jié)炎治療藥物的研發(fā)熱點(diǎn)[2]。通絡(luò)生骨膠囊是目前唯一用于治療股骨頭壞死的中藥單方，研究發(fā)現(xiàn)其具有活血健骨、化瘀止痛的作用[3]。其主要成分是木豆葉提取物，有研究發(fā)現(xiàn)木豆葉水提物可以通過(guò)激活抗氧化應(yīng)激信號(hào)通路改善心肌缺血再灌注損傷[4-5]，提示通絡(luò)生骨膠囊或可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激對(duì)軟骨細(xì)胞的損傷作用，發(fā)揮治療OA的作用。本實(shí)驗(yàn)利用通絡(luò)生骨膠囊對(duì)正常以及H2O2損傷的軟骨細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，并觀察干預(yù)后其對(duì)軟骨細(xì)胞的增殖、抗氧化應(yīng)激和Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響，從而探討通絡(luò)生骨膠囊治療骨關(guān)節(jié)炎的研究前景以及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與材料

通絡(luò)生骨膠囊：通絡(luò)生骨原料藥由海正藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為J31709061;SW13531細(xì)胞(ATCC)。RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25% Trypsin-EDTA(Gibco);TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金);SuperReal PreMix Color (SYBR Green,天根生物);SKL-2001(MCE);細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒(Promega);雙氧水(國(guó)藥集團(tuán));Trizol(Invitrogen);Nrf2(Abcam公司);HO-1、β-catenin、Keap-1(CST);Tubulin(Sigma)。

引物由上海杰瑞生物科技有限公司合成，Nrf2 上游引物：TCCA GTCA GAAA CCAG TGGA T 下游引物：GAAT GTCT GCGC CAAA AGCT G。Wnt4α上游引物：GCTC TGAC AACA TCGC CTAC 下游引物：TCGC CAGC ACGT CTTT AC。β-catenin上游引物：AGCT CCCT C GCGG TTCA T 下游引物：GGGC GGCA CCTT CCTA CTTC。GAPDH上游引物：ATGG CCTT CCGT GTTC CTAC C 下游引物：GCCC AAGA TGCC CTTC AGTG。

1.2 通絡(luò)生骨膠囊對(duì)SW1353細(xì)胞活性的影響

參考文獻(xiàn)[6],取增殖良好的SW1353細(xì)胞軟骨細(xì)胞以1 500個(gè)/孔分別接種至96孔板，置于37 ℃、5% CO2、100%相對(duì)濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h。Blank孔(純培養(yǎng)基)及Control孔(純細(xì)胞孔)加入10% FBS RPMI 1640培養(yǎng)基，給藥孔分別加入濃度為1、5、10、50和100 μg/mL的通絡(luò)生骨膠囊溶液(10% FBS RPMI 1640培養(yǎng)基配制，微孔濾膜過(guò)濾除菌后使用)。每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，振蕩混勻后，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。結(jié)束培養(yǎng)后每孔加入發(fā)光細(xì)胞活力檢測(cè)試劑100 μL，放置于恒溫振蕩器中室溫振蕩15 min，檢測(cè)細(xì)胞活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

細(xì)胞增殖率(%)=(觀察組OD值-空白組OD值)/(Control組OD值-空白組OD值)×100%

1.3 通絡(luò)生骨膠囊對(duì)SW1353的氧化保護(hù)作用

取增殖良好的SW1353細(xì)胞以1 500個(gè)/孔分別接種至96孔板，置于37 ℃、5% CO2、100%相對(duì)濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h。Blank、Control及Model孔加入10% FBS RPMI 1640培養(yǎng)基，給藥組加入含1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的通絡(luò)生骨膠囊溶液。每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，振蕩混勻后，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。72 h后，除Blank和Control孔加入1 μL 1640培養(yǎng)基，Model及給藥孔加入含H2O2的1640培養(yǎng)基1 μL(終濃度為300 μmol/L)，振蕩混勻后，37 ℃培養(yǎng)60 min。每孔加入發(fā)光細(xì)胞活力檢測(cè)試劑100 μL，放置于恒溫振蕩器中室溫振蕩15 min，檢測(cè)細(xì)胞活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

細(xì)胞增殖率(%)=(給藥組OD值-空白組OD值)/(Control組OD值-空白組OD值)×100%

1.4 通絡(luò)生骨膠囊對(duì)Nrf2/ARE及Wnt/β-catenin信號(hào)通路中 mRNA表達(dá)的影響

取增殖良好的SW1353細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種至6孔板，置于37 ℃、5% CO2、100%相對(duì)濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h。Blank、Control及Model孔加入10% FBS RPMI 1640培養(yǎng)基，給藥孔加入含1、5、10、50和100 μg/mL的通絡(luò)生骨膠囊溶液，振蕩混勻后繼續(xù)培養(yǎng)72 h。72 h后，Model及給藥孔加入10μL含H2O2溶液使其終濃度為300 μmol/L，振蕩混勻。37 ℃培養(yǎng)60 min后，棄去培養(yǎng)基，收集細(xì)胞加Trizol裂解后提取總RNA，用于檢測(cè)細(xì)胞Nrf2，HO-1，Wnt4α及β-catenin的 mRNA表達(dá)水平(實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)。熒光定量PCR檢測(cè)按照熒光定量試劑盒說(shuō)明書操作，Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀檢測(cè)，結(jié)果以相對(duì)表達(dá)定量(relative quantity，RQ)表示。

RQ=2-ΔΔCt

其中，ΔΔCt=待測(cè)標(biāo)本的ΔCt-Control標(biāo)本ΔCt；ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值。

1.5 通絡(luò)生骨膠囊對(duì)Nrf2/ARE及Wnt/β-catenin信號(hào)通路中蛋白表達(dá)的影響

取增殖良好的SW1353細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2、100%相對(duì)濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h。Blank、Control及Model孔加入10% FBS RPMI 1640培養(yǎng)基，給藥孔加入含1、5、10、50 和100 μg/mL的通絡(luò)生骨膠囊溶液，振蕩混勻后繼續(xù)培養(yǎng)72 h。72 h后，Model及給藥孔加入10 μL含H2O2溶液使其終濃度為300 μmol/L，振蕩混勻，37 ℃培養(yǎng)60 min后，棄去培養(yǎng)基，收集細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，低溫轉(zhuǎn)印至PVDF膜，牛奶封閉1 h，再與相應(yīng)的一抗、二抗雜交各1 h，用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)圖像進(jìn)行拍照和分析Nrf2、HO-1、Keap-1和β-catenin的蛋白表達(dá)水平(實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行Dunnett’s test檢驗(yàn)。P≤0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 通絡(luò)生骨膠囊對(duì)SW1353細(xì)胞存活率的影響

通絡(luò)生骨膠囊作用72 h可有效促進(jìn)SW1353細(xì)胞的增殖，與Control組相比，5、10、50 和100 μg/mL通絡(luò)生骨膠囊組細(xì)胞存活率明顯上升，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。預(yù)實(shí)驗(yàn)表明采用濃度為300 μmol/L H2O2可對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的損傷作用，與Control組相比，細(xì)胞活率僅為20%，因此后續(xù)采用該濃度為H2O2的損傷濃度；給予5、10、50、100 μg/mL通絡(luò)生骨膠囊預(yù)處理的細(xì)胞活率顯著性提高(P<0.01)，提示通絡(luò)生骨膠囊可降低H2O2對(duì)軟骨細(xì)胞的損傷,結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 通絡(luò)生骨膠囊對(duì)軟骨細(xì)胞活率的影響(%)

2.2 通絡(luò)生骨膠囊對(duì)Nrf2/ARE及Wnt/β-catenin信號(hào)通路中 mRNA表達(dá)的影響

在SW1353細(xì)胞中，與Control組相比，經(jīng)H2O2處理后細(xì)胞Nrf2和HO-1的mRNA表達(dá)受抑制，Wnt4α和β-catenin的mRNA表達(dá)上升；經(jīng)10、50和100 μg/mL通絡(luò)生骨膠囊預(yù)處理的軟骨細(xì)胞Nrf2和HO-1的mRNA表達(dá)上升，Wnt4α和β-catenin的mRNA表達(dá)水平下降，差異具有顯著性(P<0.05，P<0.01)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 Nrf2/ARE及Wnt /β-catenin信號(hào)通路中 mRNA表達(dá)水平

2.3 通絡(luò)生骨膠囊對(duì)Nrf2/ARE及Wnt/β-catenin信號(hào)通路中蛋白表達(dá)的影響

在SW1353細(xì)胞中，與Control組相比，經(jīng)H2O2處理后，細(xì)胞內(nèi)Nrf2水平略微下降，β-catenin、 HO-1及Keap-1蛋白水平上升；與Model組相比，經(jīng)50 μg/mL和100 μg/mL通絡(luò)生骨膠囊預(yù)處理可有效增強(qiáng)Nrf2及HO-1的蛋白表達(dá)，抑制Keap-1及β-catenin的蛋白表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 Nrf2/ARE及Wnt/β-catenin信號(hào)通路中蛋白表達(dá)水平

3 討論

骨性關(guān)節(jié)炎(OA)是由于一系列內(nèi)外界因素導(dǎo)致了關(guān)節(jié)的重組異常，使得軟骨細(xì)胞與基質(zhì)均發(fā)生改變，進(jìn)而關(guān)節(jié)軟骨軟化甚至喪失，軟骨下骨硬化形成骨贅[7]。軟骨細(xì)胞是骨關(guān)節(jié)腔中軟骨組成的重要細(xì)胞，其在OA的進(jìn)程中起到至關(guān)重要的作用。由于缺少神經(jīng)和血管等的分布，軟骨細(xì)胞的修復(fù)能力很低，當(dāng)外界的損傷超出軟骨細(xì)胞的修復(fù)范圍時(shí)，就會(huì)造成退行性的病變。因此維持軟骨細(xì)胞的活性、增強(qiáng)其對(duì)外界損傷的抵抗作用，對(duì)治療和延緩骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)程具有重要意義[8]。

氧化應(yīng)激是機(jī)體自身防御的一個(gè)重要體系，當(dāng)自由基、活性氧(ROS)過(guò)度產(chǎn)生，無(wú)法被及時(shí)清除時(shí)，會(huì)使得機(jī)體內(nèi)的氧化/還原失衡，從而損傷機(jī)體本身產(chǎn)生病變。氧化應(yīng)激在OA的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中起到十分重要的作用，李盛華等[9]發(fā)現(xiàn)，骨關(guān)節(jié)炎患者的骨關(guān)節(jié)腔中ROS、NO等氧自由基出現(xiàn)明顯升高，提示氧自由基參與了骨關(guān)節(jié)炎病理進(jìn)展的過(guò)程。氧化應(yīng)激還會(huì)導(dǎo)致端粒酶縮短，膠原氧化裂解、使得軟骨損傷加劇增強(qiáng)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率；ROS等還可以間接或者直接的作用在蛋白質(zhì)上，改變其構(gòu)象導(dǎo)致軟骨細(xì)胞合成代謝障礙，加速其凋亡[10]。

Nrf2/ARE信號(hào)通路是機(jī)體調(diào)節(jié)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的關(guān)鍵信號(hào)通路[11]。通過(guò)激活Nrf2/ARE抗氧化信號(hào)通路，誘導(dǎo)HO-1、GCLC等一系列細(xì)胞保護(hù)基因和解毒基因的表達(dá)，顯著增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激損傷的能力[12-13]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活與OA的形成和發(fā)展過(guò)程中起到極重要的作用[14]。Won Dong Kim等[15]研究發(fā)現(xiàn)β-catenin的下調(diào)可以有效激活Nrf2，加強(qiáng)其核定位，可進(jìn)一步加強(qiáng)Nrf2/ARE信號(hào)通路的活化發(fā)揮抗氧化作用。

在本次研究中發(fā)現(xiàn)：通絡(luò)生骨膠囊可顯著性促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖(SW1353細(xì)胞)，具有明顯的劑量效應(yīng)。通過(guò)H2O2損傷Model發(fā)現(xiàn)，不同濃度的通絡(luò)生骨膠囊(10、50和100 μg/mL)可提高軟骨細(xì)胞的存活率，降低H2O2對(duì)軟骨細(xì)胞的損傷作用。進(jìn)一步的觀察發(fā)現(xiàn)通絡(luò)生骨膠囊能誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞內(nèi)Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白表達(dá)，抑制Keap-1的蛋白表達(dá)，活化Nrf2/ARE信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化損傷作用。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)通絡(luò)生骨膠囊(50和100 μg/mL)能有效抑制軟骨細(xì)胞中H2O2誘導(dǎo)的Wnt4α及β-catenin的mRNA和蛋白表達(dá)水平上調(diào)，從而進(jìn)一步激活Nrf2/ARE信號(hào)通路，達(dá)到抗氧化損傷的作用。

綜上所述，通絡(luò)生骨膠囊可以通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化，激活Nrf2/ARE信號(hào)通路，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，降低自由基等對(duì)軟骨細(xì)胞的損傷作用，提高軟骨細(xì)胞的活率，從而延緩骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)程，提示通絡(luò)生骨膠囊具有預(yù)防和治療骨關(guān)節(jié)炎的研究前景。