腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌對(duì)IBS-D大鼠的協(xié)同治療作用研究

謝慧，陸敏，樊欣鈺

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028；3.南京市溧水區(qū)中醫(yī)院，江蘇 南京 211200；4.江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院臨床學(xué)院，江蘇 南京 211200)

腹瀉型腸易激綜合征(Diarrhea predominant irritable bowel syndrome,IBS-D)是一種臨床上常見的胃腸功能紊亂性疾病，對(duì)患者的生活質(zhì)量往往有明顯的負(fù)面影響。有流行病學(xué)調(diào)查研究顯示其患病率為10%～20%[1]，且呈逐年上升的趨勢(shì)。目前臨床尚缺乏有效的治療藥物。近些年來(lái)，中醫(yī)藥在治療IBS-D方面取得了良好的效果，且未見明顯的毒副作用；益生菌被國(guó)際益生菌和益生元科學(xué)協(xié)會(huì)(ISAPP)推薦在IBS中使用，也具有“安全無(wú)毒”的特點(diǎn)。因此，臨床上采用中藥聯(lián)用益生菌的方法治療IBS-D日益增多，但其機(jī)制尚不明確。本研究將采用名老中醫(yī)驗(yàn)方“腸康方”聯(lián)合結(jié)腸靶向益生菌干預(yù)IBS-D大鼠，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)探討其協(xié)同作用的機(jī)理，為臨床診治提供參考。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

成年健康清潔級(jí)Wistar大鼠(上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK(上海)2013-0016)。50只，體質(zhì)量(169.8±20)g，雌雄各半，SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，環(huán)境溫度(23±3)℃，濕度(55±5)%，自然光照條件。將造模成功后的大鼠進(jìn)行分組，共5組，分別為腸康方組、結(jié)腸靶向益生菌組、腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌組、模型對(duì)照組及空白對(duì)照組。每組大鼠10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

1.2.1 腸康方

采用名老中醫(yī)驗(yàn)方“腸康方”，已獲得國(guó)家發(fā)明專利(ZL201110336380.2)[2]。由白芍、防風(fēng)、熟地黃、菟絲子、黃連、金蕎麥及蟬蛻7味中藥組成，組方藥材根據(jù) 2010 版《中國(guó)藥典》的相關(guān)規(guī)定項(xiàng)進(jìn)行檢測(cè)，所有入藥的飲片均符合要求。分別加10倍、8倍量的水煎煮，每次1.5 h，合并煎煮液，濃縮至生藥量為0.5 g/mL，置4 ℃保存。用藥參照成人劑量，按照“動(dòng)物體表面積比率換算等效劑量法”計(jì)算大鼠給藥量。

1.2.2 結(jié)腸靶向益生菌

結(jié)腸靶向益生菌膠囊為一種結(jié)腸定位釋放膠囊，擁有國(guó)家發(fā)明專利(CN00117989.6)[3]。膠囊內(nèi)益生菌為同一批次培菲康(雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌)，國(guó)藥準(zhǔn)字S10950032；廠家：上海信誼；藥品電子監(jiān)管碼：81537950432214176108。并按照“動(dòng)物體表面積比率換算等效劑量法”計(jì)算大鼠給藥量，每次灌服1個(gè)膠囊。

2 方法

2.1 IBS-D大鼠模型的建立

模型采用番瀉葉灌胃疊加束縛刺激法。Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前10 h禁食不禁水，給予濃度為0.3 g/mL番瀉葉煎劑灌胃，灌胃體積為每千克體質(zhì)量10 mL，每天1次，灌服番瀉葉水1 h后立即用粗制的棉繩束縛大鼠的兩肢，使其活動(dòng)不利，焦躁不安，形成一定的刺激，持續(xù)2 h，持續(xù)2周?？瞻讓?duì)照組正常飼養(yǎng)，不采取任何措施。

2.2 給藥和取材

腸康方組、結(jié)腸靶向益生菌組、腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌組和模型對(duì)照組，分別給予腸康方灌胃、結(jié)腸靶向益生菌灌胃、腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌灌胃和等容積的蒸餾水灌胃；空白對(duì)照組給予等容積的蒸餾水灌胃。所有大鼠灌胃容積均為每千克體質(zhì)量10 mL，連續(xù)灌胃給藥2周。每日觀察一般情況，于末次給藥后次日空腹采血，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)，采血后處死并取全部結(jié)腸組織。

2.3 研究指標(biāo)

2.3.1 一般情況

觀察大鼠的精神、活動(dòng)、鼠毛、目光、食欲等情況，計(jì)算其腹瀉改善率。

2.3.2 大鼠腸道菌群的檢測(cè)

取新鮮無(wú)污染的大鼠糞便0.5 g，采用高通量測(cè)序的方法檢測(cè)腸道菌群物種的豐度、多樣性及構(gòu)成的變化趨勢(shì)，采用DNA抽提試劑盒對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，細(xì)菌多樣性鑒定對(duì)應(yīng)區(qū)域：16S V3-V4區(qū)。

2.3.3 大鼠腸組織ZO-1的表達(dá)

將大鼠處死后，取近直腸端處約1 cm結(jié)腸，固定在甲醛中，用石蠟將其包埋，進(jìn)行切片后再行免疫組化染色。免疫組化染色后，在顯微鏡下觀察，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)視野，若出現(xiàn)棕黃色染色的顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)，反之無(wú)棕黃染色則為陰性，每個(gè)視野利用拍攝器截取圖像保存。應(yīng)用Image Pro Plus 軟件測(cè)定其陽(yáng)性表達(dá)的光密度(optical density, OD)值進(jìn)行半定量分析，取其平均值,以測(cè)定結(jié)腸ZO-1的表達(dá)。棕黃色染色越多，OD值就越大，水平越高。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)錄入SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用q檢驗(yàn)及LSD檢驗(yàn)，P≤0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠的腹瀉情況

空白對(duì)照組大鼠大便正常，造模組大鼠造模前2 h排便粒數(shù)與空白對(duì)照組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模開始后，造模組大鼠造模后大便變軟，或成稀狀、稀水狀，隨著時(shí)間推移情況無(wú)明顯好轉(zhuǎn)，2 h的排便粒數(shù)與空白對(duì)照組相比較明顯增多(P<0.01)。見表1。

表1 造模前后大鼠2 h排便粒數(shù)

藥物干預(yù)后，空白組大鼠在藥物干預(yù)期間大便正常，各藥物干預(yù)組大鼠腹瀉癥狀逐漸消失，大便逐漸恢復(fù)正常，而模型對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，2 h排便粒數(shù)明顯增多；給藥干預(yù)組與模型對(duì)照組比較，2 h排便粒數(shù)均有不同程度的減少(P<0.05)，尤其以腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌組的減少最為明顯(P<0.01)。見表2。

表2 藥物干預(yù)后各組大鼠2 h排便粒數(shù)

3.2 大鼠的腸道菌群變化

與空白對(duì)照組小鼠相比，IBS-D小鼠的α多樣性指標(biāo)shannon指數(shù)明顯偏低，腸康方組、結(jié)腸靶向益生菌組及腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌組，shannon指數(shù)較模型組增加,見圖1。β多樣性分析結(jié)果見圖2，模型對(duì)照組與空白對(duì)照組大鼠腸道菌群OUT水平上的差異在PCoA及NMDS圖上能夠較好的區(qū)分，而給腸康方、結(jié)腸靶向益生菌及腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌的IBS-D大鼠腸道菌群趨向于正常組。其中腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌組IBS-D大鼠腸道菌群更趨向于正常組，說(shuō)明腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌組可更好維持腸道菌群的多樣性。

圖1 α多樣性分析

3.3 大鼠對(duì)照結(jié)腸組織ZO-1的表達(dá)

空白對(duì)照組大鼠腸組織中的ZO-1蛋白表達(dá)明顯。模型對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，結(jié)腸黏膜組織中ZO-1蛋白表達(dá)顯著降低。腸康方組與模型對(duì)照組相比，大鼠腸組織ZO-1蛋白的表達(dá)增加不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)腸靶向益生菌組大鼠腸組織ZO-1蛋白表達(dá)稍有增加，但增加程度有限(P<0.05);腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌組大鼠腸組織ZO-1蛋白表達(dá)增加較為顯著(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠腸組織ZO-1光密度值比較

圖2 β多樣性分析

4 討論

IBS-D是腸易激綜合征最常見的一個(gè)亞型，其病理機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為其與腸道菌群失調(diào)、腸道黏膜屏障和免疫功能異常、腦腸軸失調(diào)等因素有關(guān)[4]。IBS-D的發(fā)生與腸道菌群失調(diào)關(guān)系密切[5]。腸道菌群具有保護(hù)腸道黏膜的完整性、防止病原體的入侵、調(diào)節(jié)胃腸道功能及免疫系統(tǒng)等作用[6-7]。腸道菌群之間與機(jī)體之間相互依賴生存、相互克制約束，保持動(dòng)態(tài)平衡，一旦這種平衡被打破，則會(huì)引起免疫代謝紊亂，進(jìn)而發(fā)生各種腸道疾病[3]。有研究表明，腸道菌群紊亂普遍存在于IBS-D患者中，表現(xiàn)為腸桿菌數(shù)量增多，乳桿菌、類桿菌及雙歧桿菌數(shù)量降低，菌群的密集度及多樣性顯著降低等[8]。郭文濤等[9]研究顯示，IBS-D患者的腸道菌群和健康人的腸道菌群相比多樣性下降(P<0.05)，提示IBS-D的發(fā)病與菌群失調(diào)有關(guān)。Gareau等[10]用母嬰分離法構(gòu)建的IBS-D大鼠模型，研究顯示模型組大鼠的腸道乳桿菌數(shù)減少。劉佳星等[11]通過(guò)高通量測(cè)序的方法研究發(fā)現(xiàn)“四神丸”可通過(guò)增加腸道內(nèi)益生菌豐度，減少有害菌豐度，來(lái)調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)系統(tǒng)的平衡，從而起到治療IBS-D的作用。

本次研究顯示腸康方、結(jié)腸靶向益生菌及腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌均能改善IBS-D模型大鼠的腹瀉癥狀(P<0.05)，尤其是以腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌組改善最為明顯(P<0.01)。通過(guò)對(duì)各組大鼠糞便進(jìn)行高通量測(cè)序后發(fā)現(xiàn)給予腸康方、結(jié)腸靶向益生菌及腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌的IBS-D大鼠腸道菌群均趨向于正常對(duì)照組，且腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌組IBS-D大鼠的腸道菌群更趨向于正常對(duì)照組大鼠，說(shuō)明腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌組可更好的維持IBS-D大鼠腸道菌群的多樣性。

腸黏膜屏障是人體最為重要的屏障之一，它是一道維持腸腔和機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的動(dòng)能隔離帶，腸黏膜屏障可以使腸腔內(nèi)容物選擇性的通過(guò)，能夠有效的阻止病原體及其毒素侵入人體內(nèi)[12]。腸黏膜屏障功能與腸黏膜上皮細(xì)胞間的緊密連接(tight junction，TJ)息息相關(guān)[13]，TJ是一種能夠維持腸上皮黏膜屏障完整性的重要結(jié)構(gòu)[14]，而ZO蛋白對(duì)于TJ的構(gòu)成和屏障功能的維持具有重要的作用[15]。ZO-1可將跨膜蛋白和肌動(dòng)蛋白系統(tǒng)連接在一起，構(gòu)成穩(wěn)定的細(xì)胞連接系統(tǒng)，常作為一種檢測(cè)緊密連接的標(biāo)志性蛋白。有研究顯示[16],各亞型IBS大鼠存在腸黏膜機(jī)械屏障功能不足，表現(xiàn)為ZO-1減少。Martínez等[17]實(shí)驗(yàn)顯示,IBS-D患者的腸黏膜中ZO-1 mRNA表達(dá)明顯低于正常人，ZO-1從TJ解離至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，因此可致TJ結(jié)構(gòu)功能失調(diào)，黏膜通透性改變，從而導(dǎo)致IBS-D的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)各組大鼠腸組織免疫組化染色分析后發(fā)現(xiàn)IBS-D模型大鼠經(jīng)結(jié)腸靶向益生菌及腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌干預(yù)后腸組織ZO-1表達(dá)顯著增加，而以后者增加更為顯著，可見腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌能更好的通過(guò)增強(qiáng)黏膜屏障功能來(lái)達(dá)到治療IBS-D大鼠的作用。

腸康方為全國(guó)名老中醫(yī)驗(yàn)方，由明朝《景岳全書》中“痛瀉藥方”及“心腎丸”化裁而來(lái)。方中君以白芍養(yǎng)血柔肝、緩急止痛，防風(fēng)散肝舒脾、勝濕止瀉，既疏肝也能達(dá)到健脾的效用，全方共奏調(diào)和肝脾、緩?fù)粗篂a等功效。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也顯示腸康方與陽(yáng)性藥匹維溴銨均能通過(guò)減少腸組織5-羥色胺的表達(dá)，促進(jìn)5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)來(lái)達(dá)到改善IBS-D大鼠的癥狀(P<0.05)。李雪等[18]證實(shí)腸康方可使大鼠血漿P物質(zhì)減少，同時(shí)可使IBS-D大鼠結(jié)腸組織血管活性腸肽增多，以達(dá)到治療IBS-D的效果，且療效甚于陽(yáng)性藥馬來(lái)酸曲美布汀。由此說(shuō)明，腸康方對(duì)IBS-D有確切的療效。

綜上所述，腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌對(duì)IBS-D大鼠具有協(xié)同治療作用，可更好的改善模型大鼠的腹瀉癥狀，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)腸道菌群及增強(qiáng)腸黏膜屏障功能有關(guān)，但其多靶點(diǎn)的協(xié)同作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入探索。