重組腺病毒p53 基因?qū)谇击[癌患者外周淋巴細(xì)胞亞群的影響

劉三霞 王 超 鄧子輝 王 剛 王 昊 胡 敏

多種腫瘤的體外移植瘤模型和臨床研究均表明Ad-p53 的局部應(yīng)用能有效抑制腫瘤的進(jìn)展、阻止新生腫瘤的形成[1-6]。我們在既往研究中也評價(jià)了手術(shù)聯(lián)合Ad-p53 局部注射治療口腔鱗癌患者的安全性和有效性[7]。但機(jī)體對Ad-p53 局部應(yīng)用產(chǎn)生的免疫反應(yīng)還不是很清楚，而機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)對于腫瘤患者來說尤其重要，因此我們需要觀察局部應(yīng)用Ad-p53 后機(jī)體免疫功能的變化。

淋巴細(xì)胞亞群在細(xì)胞抗腫瘤免疫反應(yīng)中起重要作用。外周血中淋巴細(xì)胞亞群比例的分布反映了機(jī)體抗腫瘤免疫狀態(tài)。利用流式細(xì)胞儀分析外周血中淋巴細(xì)胞亞群在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用廣泛，其有助于多種疾病的診斷和治療，如自身免疫性疾病、免疫缺陷、感染、惡性腫瘤和器官移植等[8]。因此我們對在我院接受手術(shù)和重組人腺病毒p53 注射液(rAdp53)聯(lián)合治療的12 位口腔癌患者治療前后的外周血淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測，并與正常人群、以及僅接受手術(shù)治療的12 例口腔癌患者進(jìn)行對比分析，以評估局部注射rAd-p53 對口腔癌患者抗腫瘤免疫功能的影響。

1.資料與方法

1.1 臨床資料 共有36 例符合入選標(biāo)準(zhǔn)的口腔癌患者納入臨床研究，均為我院2012 年8 月至2015 年1 月住院并行手術(shù)治療的口腔癌患者。病例入選標(biāo)準(zhǔn)如下[7]：外周血象、肝、腎功能和凝血功能基本正常；病理檢查證實(shí)為口腔鱗狀細(xì)胞癌；病灶手術(shù)可切除，年齡大于18 周歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：有腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；既往放療或化療史；近期內(nèi)使用抗病毒藥物者，長期服用免疫抑制藥物或因其他原因引起的免疫功能缺陷者。

經(jīng)充分告知后，患者自主選擇是否行rAdp53局部注射治療，并簽署知情同意書。根據(jù)患者是否自愿接受rAdp53 治療分為用藥組(rAdp53 聯(lián)合手術(shù)治療組)和對照組(單純手術(shù)治療組)。用藥組募集15 位患者，對照組21 例，但實(shí)驗(yàn)組和對照組均只有12 名患者完成治療前及治療后淋巴細(xì)胞亞群檢測。兩組患者基本信息、發(fā)病部位、臨床分期及腫瘤分化程度等詳細(xì)資料見表1，經(jīng)非配對t 檢驗(yàn)或卡平方檢驗(yàn)，用藥組和對照組在年齡、性別、臨床分期和腫瘤分化方面均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 口腔癌患者臨床資料情況表

1.2 主要試劑及儀器 主要試劑有CD8-FITC/CD4-PE/ CD3-PC5 標(biāo)記三色熒光素抗體及其同型陰性對照，CD3-FITC/ CD56-PE/ CD16-PC5標(biāo)記三色熒光素抗體及其同型陰性對照，CD8-FITC、CD28-FITC、CD45RO-FITC、CD29-FITC、CD45RAPE、CD25-PE、HLA-DR-PE、CD19-ECD、CD8-ECD、CD3-PC5、CD4-PC7 標(biāo)記單色熒光素抗體及FITC、PE、ECD、PC5、PC7 單色同型陰性對照抗體；Q-prep 自動溶血儀、流式細(xì)胞儀(Cytometer FC 500 MPL)均為美國Beckman Coulter 公司所產(chǎn)。

1.3 方法 用藥組患者術(shù)中腫瘤擴(kuò)大切除后于手術(shù)切緣多點(diǎn)注射重組人腺病毒p53 注射液1×1012VP/ 2cm2(用生理鹽水稀釋后使用)，術(shù)后隔天給予rAd-p53 1×1012VP，共3 次。對照組患者僅行手術(shù)治療。所有患者手術(shù)前1 天、手術(shù)后1 周均抽取2ml 外周血利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群表型分析檢測。此外，為了驗(yàn)證口腔癌患者確實(shí)存在免疫功能紊亂，尤其是淋巴細(xì)胞亞群比例失衡，我們與解放軍總醫(yī)院腫瘤研究所流式檢測中心合作，募集了77 位健康志愿者，對其外周淋巴細(xì)T cell)和輔助性T 細(xì)胞(CD3+CD4+T cell)比參考值明顯降低(圖1A，unparied t test，P＜0.05)。然而，細(xì)胞毒性/ 抑制性T 細(xì)胞(CD3+CD8+T cell)和CD4+T/ CD8+T 比值僅輕度降低(圖1A，unparied t test，P＞0.05)。NK 細(xì)胞(CD3-CD16+CD56+)比例增加而NK 樣T 細(xì)胞(CD3+CD16+CD56+)降低，兩者的變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖12B，unparied t test，P＞0.05)。胞亞群進(jìn)行流式分析。這些志愿者被要求大于18周歲，性別不限，身體健康，無全身系統(tǒng)性疾病，無長期服藥史及近期服藥史。

表2 所有口腔癌患者及健康志愿者外周淋巴細(xì)胞亞群比例(M±SEM)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析，利用非配對t 檢驗(yàn)(the mean±standard error，M±SEM)對治療前口腔癌患者與健康志愿者之間以及治療前兩組間各細(xì)胞亞群比例進(jìn)行組間差異性分析；采用自身配對t 檢驗(yàn)比較兩組患者治療前后各細(xì)胞亞群比例變化規(guī)律及有無顯著性差異，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 口腔癌患者外周淋巴細(xì)胞免疫功能狀態(tài)納入研究的36 位口腔癌患者治療前均行外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測，口腔癌患者的NK 細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞亞群比例以及從健康志愿者中統(tǒng)計(jì)得到的參考值均在表2 中列出(M±SEM)。并以柱狀圖的形式對口腔癌患者與健康志愿者的各淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行了比較，如圖1。在此研究中，總T 細(xì)胞(CD3+

圖1 口腔癌患者與健康志愿者的各淋巴細(xì)胞亞群比例柱狀比較圖

根據(jù)淋巴細(xì)胞表面活化分子HLA-DR 和CD28分子的表達(dá)，檢測了外周血中活化淋巴細(xì)胞的比例。在口腔癌患者中，活化總T 細(xì)胞(CD3+HLADR+)較參考值明顯增高，同時(shí)靜止總T 細(xì)胞(CD3+HLA-DR-)比例較參考值明顯降低，兩者與參考值的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1C，unparied t test，P＜0.01)。共刺激分子CD28 的表達(dá)比例以及細(xì)胞毒 性T 細(xì) 胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs，CD8+CD28+)比例較參考值明顯降低(unparied t test，P＜0.0001)，而抑制性T 細(xì)胞(suppressor T lymphocytes，Ts，CD8+CD28-)則出現(xiàn)輕度增加(圖1D，unparied t test，P＞0.05)。

2.2 rAdp53 誘導(dǎo)的外周細(xì)胞免疫反應(yīng) 為了觀察或評價(jià)rAdp53 對患者外周淋巴細(xì)胞的影響，我們比較了用藥組和對照組之間各淋巴細(xì)胞亞群的比例。檢測值以M±SEM 的形式在表2 中列出，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得到的P 值見表3。圖2 為實(shí)驗(yàn)組和對照組患者淋巴細(xì)胞亞群比例分布的散點(diǎn)圖。檢測結(jié)果如下：治療前實(shí)驗(yàn)組和對照組各淋巴細(xì)胞亞群比例均無明顯差異(unpaired t test，P＞0.05)。治療后對照組總T 細(xì)胞(CD3+T) 和CD8+T 比例均降低，而CD4+輔助性T 細(xì)胞比例和CD4/ CD8 比值增加；用藥組患者治療后總T 細(xì)胞比例變化與對照組相同，均較治療前降低，而CD4+輔助性T 細(xì)胞和CD4/ CD8 比值下降，CD8+T 細(xì)胞無變化。NK 細(xì)胞在用藥組中比例輕度增高而在對照組中輕度降低；NKT 細(xì)胞變化趨勢同NK 細(xì)胞。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，這些變化均無顯著性差異(圖2A，B，paried t test，P＞0.05)。

實(shí)驗(yàn)組患者治療后活化總T 細(xì)胞和細(xì)胞毒性T 細(xì)胞較治療前均增加，而靜止性總T 細(xì)胞和抑制性T 細(xì)胞較治療前降低。相反，對照組的活化總T 細(xì)胞和細(xì)胞毒性T 細(xì)胞治療后比例均低于治療前(圖2C，D)，同時(shí)抑制性T 細(xì)胞比例也較治療前增加。盡管這些變化中，僅實(shí)驗(yàn)組靜止性T 細(xì)胞比例降低與治療前相比具有顯著性差異(Ts，P＜0.05)，但其他細(xì)胞亞群的增加-降低趨勢是很明顯的。

3.討論

腫瘤細(xì)胞和免疫系統(tǒng)之間的相互作用非常復(fù)雜，在惡性腫瘤患者中往往存在機(jī)體免疫平衡失調(diào)，尤其是在機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)中起重要調(diào)控作用的T 淋巴細(xì)胞亞群出現(xiàn)平衡失調(diào)。癌癥患者包括頭頸癌已被公認(rèn)為存在免疫功能紊亂[9-10]，也有證據(jù)表明口腔癌患者外周血淋巴細(xì)胞和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞存在著免疫缺陷[11]。外周細(xì)胞免疫功能缺陷影響頭頸癌患者預(yù)后，如外周血中CD8+T 細(xì)胞[12]、NKT 細(xì)胞[13]比例降低被認(rèn)為與預(yù)后差相關(guān)。NK細(xì)胞比例降低被認(rèn)為可能導(dǎo)致了頭頸癌患者免疫逃逸的結(jié)果[14]。因此在頭頸癌患者外周血中檢測機(jī)體自身腫瘤特異性T 細(xì)胞反應(yīng)和抗腫瘤治療或者免疫治療誘導(dǎo)的腫瘤特異性反應(yīng)是必要的。在我們的研究中，口腔癌患者總T 細(xì)胞和CD4+T 細(xì)胞比例較健康人群明顯降低，共刺激信號分子CD28 的表達(dá)比例、細(xì)胞毒性T 細(xì)胞比例明顯降低而抑制性T 細(xì)胞比例增高。此外，活化總T 細(xì)胞明顯增加而靜止總T 細(xì)胞明顯降低。這些淋巴細(xì)胞亞群比例的變化(與健康人群比較)具有顯著性差異，這種淋巴細(xì)胞亞群比例分布異常表明口腔癌患者確實(shí)存在免疫功能缺陷。

表3 不同組間外周淋巴細(xì)胞亞群T 檢驗(yàn)P 值表

圖2 用藥組和非用藥組患者淋巴細(xì)胞亞群比例分布的散點(diǎn)圖

手術(shù)治療或聯(lián)合放化療是口腔癌治療的主要方法。放化療對骨髓具有明顯抑制作用，而之前的研究發(fā)現(xiàn)癌癥患者手術(shù)后淋巴細(xì)胞的免疫功能可不同程度的恢復(fù)[15-16]。這可能與瘤體去除后，腫瘤產(chǎn)生的免疫抑制因子減少或消失有關(guān)；或者手術(shù)能誘導(dǎo)創(chuàng)傷應(yīng)激反應(yīng)從而增強(qiáng)抗腫瘤免疫功能。然而，也有一些研究表明由于殘留的微小病灶存在、手術(shù)創(chuàng)傷的刺激以及放化療的副作用，使癌癥患者的免疫抑制狀態(tài)在治療后會持續(xù)很長時(shí)間[15]。Bottcher[17]等發(fā)現(xiàn)外周血中T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞的比例分布與患者接受到的治療方式相關(guān)，尤其易受手術(shù)聯(lián)合放化療治療方法的影響。在本研究中，對照組患者手術(shù)前后各淋巴細(xì)胞亞群比例無明顯變化，表明對照組患者在接受手術(shù)治療后免疫抑制狀態(tài)仍然存在。因此，在進(jìn)行手術(shù)或放化療的同時(shí)，適時(shí)采取相應(yīng)的輔助措施，增強(qiáng)腫瘤患者的免疫功能，可能能更好的抑制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

大量的研究表明重組腺病毒攜帶的wtp53 基因抗腫瘤療效主要與wtp53 基因抑制細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用相關(guān)。但也有些研究認(rèn)為p53 與免疫系統(tǒng)之間的密切關(guān)系在有效抑制甚至消滅腫瘤細(xì)胞的過程中起重要作用[18]。比如，p53 蛋白能作為腫瘤相關(guān)抗原刺激免疫反應(yīng)。此外，p53 還能作為轉(zhuǎn)錄因子，直接激活免疫細(xì)胞某些基因的表達(dá)，在這些細(xì)胞的增殖和功能方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。野生型p53 功能的缺乏通過干擾炎性調(diào)節(jié)因子的表達(dá)來影響固有免疫反應(yīng)[19]。外源性wtp53 轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后能作為腫瘤特異性抗原激活NK細(xì)胞[20]和T 細(xì)胞[21]。通過復(fù)制缺陷型腺病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的wtp53 在腫瘤細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)，導(dǎo)致p53 蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)積聚。一部分壞死的腫瘤細(xì)胞釋放的P53 蛋白被抗原提呈細(xì)胞加工提呈給T 細(xì)胞。P53 特異性T 細(xì)胞被活化并誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)[18]。還有些文獻(xiàn)報(bào)道野生型和突變型p53 蛋白特異性多肽能在正常鼠或荷瘤鼠體內(nèi)誘導(dǎo)MHC-II限制性CD4+T 細(xì)胞活化[22-23]。在我們的研究中，用藥組患者HLA-DR 分子的表達(dá)和活化總T 細(xì)胞的比例在治療后較治療前明顯增加而靜止總T細(xì)胞明顯降低。相反，對照組患者治療前后無明顯變化。

有文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)注射Ad-p53 后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)過量表達(dá)外源性野生型p53 蛋白，能被細(xì)胞內(nèi)NKG2D 分子提呈到細(xì)胞表面，作為腫瘤抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生腫瘤特異性的CTL 細(xì)胞[24]。這與本研究中用藥組患者治療后細(xì)胞毒性T 細(xì)胞比例較治療前上調(diào)，而抑制性T 細(xì)胞比例降低相符合。變化幅度雖未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但這種增加-降低的趨勢很明顯。變化無顯著性差異可能與納入研究的口腔癌患者數(shù)目少有關(guān)。Hoffmann[25]與Tsukishiro 等[26]發(fā)現(xiàn)頭頸癌患者外周循環(huán)中CD8+T 細(xì)胞尤其是細(xì)胞毒性T 細(xì)胞對凋亡非常敏感，甚至是凋亡的首選靶細(xì)胞。這可能是用藥組細(xì)胞毒性T 細(xì)胞的增加幅度未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的另一重要原因。

NK 細(xì)胞主要在外周血中循環(huán)。然而，在某些病理?xiàng)l件下如病毒或細(xì)菌感染，NK 細(xì)胞能選擇性的聚集在感染的組織部位[27]。腺病毒載體是目前用于基因轉(zhuǎn)染最有效的載體之一，它具有免疫原性，能誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，這種炎性反應(yīng)曾被認(rèn)為是腺病毒作為載體的副作用。然而，腺病毒載體誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)能激活抗腫瘤免疫效應(yīng)細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞，從而在短時(shí)間內(nèi)增強(qiáng)抗腫瘤反應(yīng)。而且，一些研究表明NK 細(xì)胞能表達(dá)一些趨化因子受體，對一些趨化因子產(chǎn)生反應(yīng)[28]。p53 可以轉(zhuǎn)錄上調(diào)Ⅳ型跨膜趨化因子Fractalkine 的表達(dá)，表達(dá)Fractalkine 的癌細(xì)胞可與表達(dá)Fractalkine 受體的NK 細(xì)胞緊密結(jié)合，從而被NK 細(xì)胞殺滅。一項(xiàng)關(guān)于Ad-p53 治療卵巢癌的研究表明NK 細(xì)胞在Ad-p53 產(chǎn)生的旁觀效應(yīng)中起重要作用[20]。在本研究中，用藥組NK 細(xì)胞比例輕度增加，而對照組輕度降低。NK 細(xì)胞比例在兩組中的不同變化趨勢可能與是否接受rAdp53 治療有關(guān)。我們推測本研究中有限的患者數(shù)目是導(dǎo)致NK 細(xì)胞比例在兩組中的變化均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的原因。

綜上所述，我們在此研究中檢測并分析了口腔癌患者的細(xì)胞免疫功能狀態(tài)以及比較了接受rAdp53治療患者淋巴細(xì)胞亞群比例的變化，我們發(fā)現(xiàn)口腔癌患者確實(shí)存在抗腫瘤免疫功能缺陷，手術(shù)在短時(shí)間內(nèi)并不能有效改善患者的抗腫瘤免疫功能。而作為輔助治療手段，在圍手術(shù)期局部應(yīng)用rAd-p53能在一定程度上增強(qiáng)患者的抗腫瘤免疫能力。由于本研究中患者的隨訪期還較短，rAd-p53 對口腔癌患者產(chǎn)生的外周淋巴細(xì)胞亞群的變化能維持多長時(shí)間及其與患者預(yù)后的關(guān)系尚不能進(jìn)行分析，但從用藥后免疫功能改善這方面推測，口腔癌患者可能從手術(shù)聯(lián)合rAd-p53 局部應(yīng)用治療中獲益。